李 威，李國瑞,2,3,4，黃鳳蘭,2,3,4，叢安琪，李曉晨，白英俊，李孟建，陳永勝，2，3，4

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028000;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新培育中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

蓖麻(RicinuscommunisL.)是大戟科蓖麻屬植物，蓖麻油廣泛應(yīng)用于國防、農(nóng)業(yè)、化工、醫(yī)藥和機(jī)械制造等方面，具有重要的商業(yè)價(jià)值[1]。我國是世界第二大蓖麻籽生產(chǎn)國，北起黑龍江，南至海南島均有種植[2]。與主要農(nóng)作物相比，蓖麻產(chǎn)量相對低，這極大地限制了蓖麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。矮稈蓖麻植株較矮，營養(yǎng)體小(80～150 cm)，占據(jù)空間小，水分、養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)木嚯x相對較短，經(jīng)濟(jì)系數(shù)相對高，提高了養(yǎng)分、水分的利用率，增強(qiáng)了其抗倒伏、抗旱性和耐瘠薄能力，若遇強(qiáng)降雨、大風(fēng)等惡劣天氣，矮稈蓖麻防災(zāi)抗災(zāi)能力大大增強(qiáng)，提高了瘠薄地、邊際地的利用效率，進(jìn)而提高蓖麻產(chǎn)量，所以蓖麻矮化育種研究成為熱點(diǎn)。

赤霉素(GA)是一類調(diào)節(jié)植物生長的重要激素，主要在植物的頂端幼嫩部位合成，如莖尖和根尖，在生長中的種子和果實(shí)中也大量合成。GA在種子萌發(fā)、莖伸長、子葉伸展、下胚軸伸長以及成花誘導(dǎo)等生命活動中發(fā)揮重要作用。DELLA蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控元件。它的生物學(xué)功能是負(fù)向調(diào)節(jié)GA 信號途徑，抑制植物生長發(fā)育[3-9]。DELLA蛋白的氨基酸序列中，N端的同源性不高，但均具有DELLA 和TVHYNP 2個(gè)保守的酸性結(jié)構(gòu)域。一般認(rèn)為，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域的突變影響蛋白與赤霉素受體GID1的結(jié)合能力[10-11]。隨著對DELLA蛋白研究的深入，DELLA基因已經(jīng)在多種植物被克隆和表達(dá)分析，水稻中的SLR1基因、小麥中的RHT-1基因、玉米中的D8基因[12]、大麥中的SLN1基因、甜櫻桃中的PaGAI基因[13]、棉花中的GhGAI3、GhGAI4、GhGAI2b、GhGAI4b基因[14-17]以及擬南芥中的GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3。Thomas等[18]驗(yàn)證了DELLA蛋白和GA調(diào)控?cái)M南芥種子萌發(fā)和花的發(fā)育。Hou等[19]以野生型和della缺失突變體擬南芥為材料，發(fā)現(xiàn)在沒有GA存在的條件下，DELLA結(jié)合JAZ，釋放MYC2促進(jìn)下游JA效應(yīng)基因的表達(dá)。Boccaccini等[20]發(fā)現(xiàn)DOF蛋白的DAG1和DELLA蛋白的GAI共同作用,負(fù)向調(diào)控AtGA3oxl基因，進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥的生長。Hussain等[21]研究發(fā)現(xiàn)，DELLA與兩HD-ZIP的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制擬南芥生長。大量試驗(yàn)證明DELLA過表達(dá)植株可以明顯抑制GA的作用，顯著降低株高。本試驗(yàn)通過克隆蓖麻DELLA基因完整閱讀框并對其進(jìn)行生物學(xué)信息分析，為進(jìn)一步研究DELLA蛋白對蓖麻的矮化作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 蓖麻2129品系由內(nèi)蒙古通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，取自2129植株六葉期莖尖，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑及菌株 Pyrobest DNA 聚合酶、T4DNA連接酶、DNA Marker(購自寶生物有限公司)；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pMD-18T載體(購自北京莊盟國際科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA 采用TaKaRa的RNA提取試劑盒提取蓖麻2129生長六葉期莖尖的總RNA，備用。參照TaKaRa公司的cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2DELLA基因的克隆 根據(jù)NCBI上公布的蓖麻DELLA的全長序列，設(shè)計(jì)5′端引物primer2：5′-ATGAAAAGAGAACACCAAGAAAGCAAA

GG-3′，3′端引物primer1：5′-CTTTGAATCGCTG

AGTTGCCAAG-3′(圖1)。以蓖麻2129六葉期莖尖的總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：cDNA 100 ng，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)3 μL，上下游引物各1 μL，Pyrobest DNA 聚合酶2.5 μL，總體積50 μL。PCR 程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸2 min，28 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落，放大培養(yǎng)后將陽性克隆送至GENERAY公司測序。

1.2.3DELLA基因的生物信息學(xué)分析 克隆得到的DELLA基因序列，利用在線工具ProtParam程序(http：//web.Expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)的分子式、分子量、等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)等；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白質(zhì)跨膜型進(jìn)行預(yù)測；用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽分析；用Predict-protein(http://www.Predictprotein.org)程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用Phyre 2 軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)對蓖麻RcDELLA基因的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；在線工具ProtFun 2.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)進(jìn)行了功能預(yù)測分析；采用Interproscan ( http: //www.Ebi.Ac.uk /interpro /scan.html)軟件對RcDELLA同源序列進(jìn)行保守序列和結(jié)構(gòu)域分析。

The full-length sequence of DELLA gene of castor 2 146 bp

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻總RNA的提取

由圖2可知，利用RNA提取試劑盒法提取蓖麻六葉期莖尖的總RNA，經(jīng)電泳檢測后28S和18S核糖體RNA亮度接近2∶1，且沒有DNA 污染，紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示OD260/280為1.95，說明提取的蓖麻莖尖總RNA純度高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 蓖麻總RNA提取結(jié)果Fig.2 Extraction of total RNA from castor

2.2 RcDELLA基因及編碼的氨基酸特征分析

在已知序列的基礎(chǔ)上對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得DELLA完整開放閱讀框全長為1 701 bp(圖3)，編碼567個(gè)氨基酸，其中亮氨酸(Leu)最多，有61個(gè)，占10.8%；其次是絲氨酸(Ser)有57個(gè)，占10.1%；丙氨酸(Ala)有50個(gè)，占8.8%；谷氨酸(Glu)40個(gè)，占7.1%。根據(jù)ExPASyProtParam預(yù)測：RcDELLA基因編碼的蛋白分子式為C2744H4296N764O860S25，分子量為62 550.40 ku，等電點(diǎn)為5.14，不穩(wěn)定系數(shù)為49.86，被歸類為不穩(wěn)定蛋白，GRAVY為-0.847，為親水性蛋白。RcDELLA中帶負(fù)電荷的殘留物總數(shù)為70，帶正電荷的殘留物總數(shù)為47，半衰期為30 h。利用SignalP進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽分析，發(fā)現(xiàn)RcDELLA序列含有信號肽，為分泌蛋白。利用 TMHMM Server v. 2.0 網(wǎng)站對RcDELLA的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明RcDELLA蛋白質(zhì)無跨膜結(jié)構(gòu)域，這與理化性質(zhì)分析此蛋白為親水性蛋白的結(jié)果相一致。

M．DL2000 Marker; 1．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M．DL2000 Marker; 1．PCR product.

2.3 DELLA蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Predict-protein對DELLA蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，其中α-螺旋占40.4%，β-折疊占8.6%，無規(guī)則卷曲占51.0%。利用Phyre 2網(wǎng)站對蓖麻DELLA基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見圖4。

圖4 RcDELLA蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of RcDELLA

2.4 RcDELLA同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對蓖麻RcDELLA與柑橘(Citrussinensis，XP_006482132.1)、木本棉(Gossypiumarboreum,XP_017606442.1)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis,ALG02536.1)、麻瘋樹(Jatrophacurcas,XP_012077792.2)、核桃(Juglansregia,XP_018816848.1)、蘋果(Malusdomestica,NP_001315916.1 )、芍藥(Paeonialactiflora,ANA05341.1)、胡楊(Populuseuphratica,XP_011002785.1 )、桃(Prunuspersica,XP_007214956.1 )、中國李(Prunussalicina,AQQ12221.1 )、葡萄(Vitisvinifera,XP_002266267.1 )、金絲小棗(Ziziphusjujuba,XP_015872191.1 )12種DELLA氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(圖5)，其中與巴西橡膠樹相似性為73.87%，與柑橘相似性為74.49%，13個(gè)氨基酸序列N端的保守性不高，但均具有DELLA 和TVHYNP 2個(gè)保守的酸性結(jié)構(gòu)域。

利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果表明，RcDELLA先與大戟科巴西橡膠樹(ALG02536.1)和麻瘋樹(XP_012077792.2)形成分支，結(jié)果符合進(jìn)化關(guān)系，與同源性比對結(jié)果一致。

2.5 RcDELLA蛋白的功能預(yù)測分析及保守序列和結(jié)構(gòu)域分析

利用在線工具ProtFun 2.2 Server進(jìn)行了功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)此基因的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合(表1)。

向右箭頭為DELLA保守結(jié)構(gòu)域；向左箭頭為TVHYNP保守結(jié)構(gòu)域；五角星為蓖麻DELLA氨基酸序列。Ps_DELLA.中國李；Hb_DELLA.巴西橡膠樹；Ga_DELLA.木本棉；Cs_DELLA.柑橘；Jr_DELLA.核桃；Pp_DELLA.桃；Pe_DELLA.胡楊；Pl_DELLA.芍藥；Md_DELLA.蘋果；Vv_DELLA.葡萄；Rc_DELLA.蓖麻；Zj_DELLA.金絲小棗；Jc_DELLA.麻瘋樹。

The right arrow is the conservative domain of the DELLA; the left arrow is the TVHYNP conservative domain；five-pointed star is a castor DELLA amino acid sequence；Ps_DELLA.Prunussalicina;Hb_DELLA.Heveabrasiliensis; Ga_DELLA.Gossypiumarboretum; Cs_DELLA.Citrussinensis; Jr_DELLA.Juglansregia; Pp_DELLA.Prunuspersica; Pe_DELLA.Populuseuphratica; Pl_DELLA.Paeonialactiflora; Md_DELLA.Malusdomestica; Vv_DELLA.Vitisvinifera; Rc_DELLA.Ricinuscommunis; Zj_DELLA.Ziziphusjujube; Jc_DELLA.Jatrophacurcas.

圖5不同植物DELLA基因氨基酸序列同源性比較
Fig.5AlignmentofdeducedaminoacidsequencesofDELLAgenesofdifferentplants

利用Interproscan對RcDELLA同源序列進(jìn)行保守序列和結(jié)構(gòu)域分析(圖7)，結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示RcDELLA具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子DELLA域和2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子GRAS域，進(jìn)一步證實(shí)該基因具有DELLA蛋白結(jié)構(gòu)。

3 討論

赤霉素(GA)是一類調(diào)節(jié)植物生長的重要激素，調(diào)控植物生長發(fā)育的各個(gè)階段，包括種子的發(fā)芽、莖稈的伸長、開花時(shí)間、花與果實(shí)的成熟等許多不同的發(fā)育過程。DELLA蛋白負(fù)向調(diào)節(jié)GA 信號途徑，抑制植株生長發(fā)育。當(dāng)DELLA蛋白上的GA信號感知區(qū)接收到GA信號后, 這種蛋白的阻遏作用被解除，植株表現(xiàn)出瘦高的表型,但當(dāng)DELLA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或者過表達(dá)則不能降解或降解完全，從而使植株表現(xiàn)出矮化表型[22-23]。

圖6 RcDELLA的進(jìn)化樹分析Fig.6 Molecular phylogenic tree of RcDELLA from plants

功能Function可能性Possibility可能率Odds生物合成的輔因子Cofactorsofbiosynthesis0.0380.530細(xì)胞外被膜Capsuleofextracellular0.0320.523細(xì)胞加工Cellprocessing0.0270.373中間代謝Intermediatemetabolism0.0410.658能量代謝Energymetabolism0.1121.242脂肪酸代謝Fattyacidmetabolism0.0171.303嘌呤嘧啶Purinepyrimidine0.0640.265轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合Transportcombined0.8342.033

圖7 RcDELLA保守序列和結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Analysis of conserved sequence and domain of RcDELLA

本試驗(yàn)克隆得到了1 701 bp的蓖麻RcDELLA蛋白基因cDNA 完整的開放閱讀框序列，推測其可編碼567 個(gè)氨基酸的多肽。蓖麻RcDELLA蛋白含有典型的DELLA和TVHYNP 2個(gè)保守的酸性結(jié)構(gòu)域，這與NCBI上公布的其他植物的DELLA蛋白序列具有高度的同源性。通過理化性質(zhì)、跨膜分析、信號肽預(yù)測和結(jié)構(gòu)域分析顯示:RcDELLA序列含有信號肽，為分泌蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域，這與理化性質(zhì)分析此蛋白為親水性蛋白結(jié)果相一致。功能預(yù)測分析表明，該蛋白的主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合。隨著對DELLA蛋白研究的深入，它在植物生長發(fā)育過程的作用也受到越來越多的關(guān)注，利用分子生物學(xué)方法對蓖麻的RcDELLA基因進(jìn)行克隆和分析，為進(jìn)一步對蓖麻DELLA蛋白在植物體內(nèi)作用機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。目前，水稻、玉米、小麥等作物均已通過分子手段培育出了矮化的新品種，但在蓖麻中還未見報(bào)道。在下一步試驗(yàn)中，可以將RcDELLA基因轉(zhuǎn)入野生蓖麻中，以期獲得DELLA蛋白過表達(dá)的矮稈蓖麻表型。

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