蔡 肖，甄軍波，江振興，劉琳琳，劉 迪，張建宏，田海燕，張香云，遲吉娜

(1．河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2.河北行政學(xué)院，河北 石家莊 050031)

JAZ蛋白是茉莉素(JA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分，扮演著轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，在植物抵御非生物逆境中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用。在擬南芥中，JAZ基因能夠被機(jī)械損傷、臭氧、高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[1-2]。AtJAZ10超表達(dá)的擬南芥植株表現(xiàn)出對(duì)茉莉素響應(yīng)不敏感，并降低了由脅迫損傷而導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制[3]。水稻所有JAZ基因均受到至少一種非生物脅迫(鹽、干旱、低溫)誘導(dǎo)表達(dá)[4]。大豆GsJAZ2基因在擬南芥中的超量表達(dá)，增加了擬南芥對(duì)鹽堿脅迫的敏感性，即降低了擬南芥對(duì)鹽堿脅迫的耐性，表明該基因參與并干擾了植物在應(yīng)對(duì)鹽脅迫逆境過(guò)程中的防御機(jī)制[5-6]。大多數(shù)葡萄VvJAZ基因均受JA、ABA和環(huán)境脅迫(低溫、干旱和鹽堿)誘導(dǎo)響應(yīng)，并且除VvJAZ1外的其他冷脅迫響應(yīng)基因同時(shí)也是干旱或者高鹽脅迫響應(yīng)基因[7]。

其他物種中的研究表明，JAZ類基因具有普遍的非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)特性，在植物抵御非生物逆境傷害中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。在棉花中，有關(guān)JAZ基因的研究還相對(duì)較少。隨著棉花基因組測(cè)序的完成，JAZ所屬的TIFY家族的全基因組鑒定相繼完成[8-10]。Hu等[11]發(fā)現(xiàn)，GhJAZ2通過(guò)與R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子GhMYB25-like等互作負(fù)調(diào)控棉花纖維起始發(fā)育。然而，有關(guān)棉花JAZ基因抵御逆境脅迫作用機(jī)理的研究還有待進(jìn)一步深入。本研究從棉花品種中棉所36低溫轉(zhuǎn)錄組中篩選得到了一個(gè)低溫響應(yīng)基因GhJAZ1(登錄號(hào)KJ562212)，分析了其生物信息學(xué)特征，對(duì)其組織表達(dá)特征以及激素和低溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，并檢測(cè)了其亞細(xì)胞定位特征，為揭示GhJAZ1在棉花低溫逆境響應(yīng)中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試陸地棉品種中棉所36由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，冀棉958由分子育種課題組種植保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理方法 中棉所36種子經(jīng)硫酸脫絨后，直接播種于營(yíng)養(yǎng)土中，放置在培養(yǎng)箱(白天28 ℃，夜晚26 ℃，濕度70%)中生長(zhǎng)。待棉苗長(zhǎng)到2片真葉展開(kāi)時(shí)，對(duì)棉株進(jìn)行脅迫處理。

激素脅迫處理：選擇生長(zhǎng)整齊健壯的棉苗，葉面噴施0.1 mmol/L 脫落酸(ABA)和0.1 mmol/L 茉莉酸甲酯(MeJA)處理0，1，3，6 h。

低溫脅迫處理：將生長(zhǎng)整齊健壯的棉苗移到4 ℃的培養(yǎng)箱中，處理0，3，6，12，24 h。

處理結(jié)束后，迅速剪取植株真葉，置于液氮中速凍后，-80 ℃保存。

1.2.2GhJAZ1基因克隆 根據(jù)分子設(shè)計(jì)育種實(shí)驗(yàn)室中棉所36低溫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的JAZ基因序列片段，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該基因的PCR引物(表1)。提取低溫處理12 h的中棉所36葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增反應(yīng)采用TaKaRa公司的LATag酶，反應(yīng)體系含TaKaRa LATag酶(5 U/μL)0.5 μL，10×LA PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixture 8 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至終體積50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，連接到pMD18-T(TaKaRa)載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB瓊脂板，37 ℃培養(yǎng)16～20 h，篩選陽(yáng)性克隆，然后送測(cè)序。本試驗(yàn)引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成，DNA聚合酶、載體購(gòu)自TaKaRa，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2.3GhJAZ1生物信息學(xué)分析 利用Clustalx 1.83、MEGA 4.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用DNAMAN軟件進(jìn)行保守域分析。利用Expasy軟件( http://www.expasy.ch/)對(duì)蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析。利用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Nephos/)和TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/server/TMHMM/)在線分析蛋白磷酸化位點(diǎn)和跨膜域。利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用SOPM(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)在線程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4GhJAZ1基因表達(dá)分析 提取中棉所36不同組織(胚根、子葉、3周齡的根、莖、葉)以及ABA、MeJA和低溫處理的葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。以陸地棉組蛋白基因Histone3作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)GhJAZ1特異引物GhJAZ1-qRT-F和GhJAZ1-qRT-R(表1)在Q-TOWER定量PCR儀(Analytik Jena，Germany)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。按照TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.5 GhJAZ1亞細(xì)胞定位觀察 根據(jù)GhJAZ1基因的ORF序列和pCAMBIA1302載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物GhJAZ1-F2和GhJAZ1-R2(表1)。用LATag酶擴(kuò)增獲得GhJAZ1的ORF序列，連接到pCAMBIA1302載體上，得GFP：GhJAZ1瞬時(shí)表達(dá)載體。將該載體利用煙草注射異源表達(dá)蛋白的方法注入煙草[12]，使用帶有GFP濾鏡的激光共聚焦顯微鏡FV10-ASW(購(gòu)自日本Olympus)在488 nm波長(zhǎng)下，觀察目的蛋白亞細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhJAZ1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

以中棉所36的葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，克隆到pMD18-T載體上。選取3個(gè)獨(dú)立的基因轉(zhuǎn)化子送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全一致。將測(cè)序得到的序列進(jìn)行BlastX分析及ORF finder預(yù)測(cè)，最終確定出GhJAZ1的全長(zhǎng)CDS序列，大小為810 bp(圖1)，上傳至NCBI(GenBank登錄號(hào)：KJ562212)。

M.DL2000 Marker; 1.GhJAZ1基因。M.DL2000; 1.GhJAZ1 gene.

2.2 GhJAZ1生物信息學(xué)分析

根據(jù)在線軟件ProtParam的分析結(jié)果顯示，GhJAZ1蛋白長(zhǎng)度為270個(gè)氨基酸殘基，分子量約29.808 ku，等電點(diǎn)pI約為8.33。CELLO亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，GhJAZ1蛋白定位于細(xì)胞核中。Netphos分析GhJAZ1蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)肽鏈中3種磷酸化位點(diǎn)都存在，但以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，酪氨酸最少(圖2)。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，GhJAZ1蛋白為非跨膜蛋白。

5.與時(shí)俱進(jìn)、務(wù)實(shí)創(chuàng)新，是“楓橋經(jīng)驗(yàn)”創(chuàng)新發(fā)展的不竭動(dòng)力?！皸鳂蚪?jīng)驗(yàn)”能始終站在時(shí)代前列和實(shí)踐前沿，順應(yīng)時(shí)代性，把握規(guī)律性，富于創(chuàng)造性，不斷推動(dòng)理念創(chuàng)新、方式方法創(chuàng)新、技術(shù)創(chuàng)新、體制機(jī)制創(chuàng)新，不斷形成新的實(shí)踐成果、制度成果和理論成果，從而使生命之樹(shù)常青。

圖2 GhJAZ1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 The predicted phosphorylation sites in GhJAZ1

用SOPM在線程序?qū)hJAZ1基因編碼蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白的92個(gè)氨基酸可能形成α螺旋，32個(gè)氨基酸可能形成延伸帶，18個(gè)氨基酸可能形成β轉(zhuǎn)角，128個(gè)氨基酸可能形成無(wú)規(guī)則卷曲，組成α螺旋、延伸帶、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的氨基酸比例分別為34.07%，11.85%，6.67%和47.41%。

根據(jù)GhJAZ1氨基酸序列在NCBI中BlastP的比對(duì)結(jié)果，GhJAZ1與可可樹(shù)(EOY27299.1)、黃麻(OMO66076.1)的JAZ蛋白的相似性較高，分別為77%和76%，與擬南芥(NP_565043.1)的相似性為41%。選取可可樹(shù)(EOY27299.1)、黃麻(OMO66076.1)、棗(XP_015902663.1)、葡萄(XP_002272363.2)、橡膠(AIY25007.1)、蓖麻(XP_002529200.1)、毛白楊(AKT94819.1)、擬南芥(NP_565043.1)和大豆(NP_001276248.1)9個(gè)代表性物種的JAZ氨基酸序列，與陸地棉GhJAZ1進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)。序列比對(duì)結(jié)果表明，不同植物JAZ在氨基酸序列上保守性較高，且都具有完整保守的功能結(jié)構(gòu)序列(圖3)。GhJAZ1蛋白具有一個(gè)N端NT結(jié)構(gòu)域，一個(gè)TIFY保守結(jié)構(gòu)域(TIFFGG模式)和一個(gè)C端極度保守的Jas結(jié)構(gòu)域，屬于TIFY基因家族。

GhJAZ1.棉花KJ562212；TcJAZ.可可樹(shù)EOY27299.1；CoJAZ.黃麻OMO66076.1；ZjJAZ.棗XP_015902663.1；VvJAZ.葡萄XP_002272363.2；HbJAZ.橡膠AIY25007.1；PtJAZ.毛白楊A(yù)KT94819.1；RcJAZ.蓖麻XP_002529200.1；AtJAZ.擬南芥NP_565043.1；GmJAZ.大豆NP_001276248.1。虛線方框.NT結(jié)構(gòu)域；雙實(shí)線方框.TIFY結(jié)構(gòu)域；單實(shí)線方框.Jas結(jié)構(gòu)域。

GhJAZ1.GossypiumKJ562212;TcJAZ.TheobromacacaoEOY27299.1; CoJAZ.CorchorusolitoriusOMO66076.1;ZjJAZ.ZiziphusjujubeXP_015902663.1;VvJAZ.VitisviniferaXP_002272363.2;HbJAZ.HeveabrasiliensisAIY25007.1;PtJAZ.PopulustomentosaAKT94819.1;RcJAZ.RicinuscommunisXP_002529200.1;AtJAZ.ArabidopsisthalianaNP_565043.1;GmJAZ.GlycinemaxNP_001276248.1.Dash line box.NT domain; Double solid line box.TIFY domain;Single solid line box.Jas domain.

圖3不同植物JAZ氨基酸序列比較
Fig.3AlignmentofaminoacidsequencesofJAZsfromdifferentplantspecies

為研究GhJAZ1與其他物種JAZ的進(jìn)化關(guān)系，用ClastalW對(duì)氨基酸序列比對(duì)后，利用MEGA 5.0軟件，采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)(圖4)，進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，棉花GhJAZ1與可可樹(shù)(EOY27299.1)和黃麻(OMO66076.1)JAZ蛋白進(jìn)化距離最近，而這3個(gè)物種在經(jīng)典分類學(xué)上都屬被子植物門雙子葉植物綱錦葵目。

2.3 GhJAZ1基因的表達(dá)分析研究

為了研究GhJAZ1基因的組織表達(dá)特征，以Histone3為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測(cè)了該基因在中棉所36萌發(fā)3 d的下胚軸和子葉以及3周齡的根、莖、葉中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，該基因不同組織中表達(dá)量差異很大，在下胚軸中的表達(dá)量最高，莖中最低，其中下胚軸和根中該基因的表達(dá)量與子葉相比存在極顯著差異(圖5)。

圖4 GhJAZ1與其他物種同源氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of GhJAZ1 of G.hirsutum L.and JAZs of other species

**.樣本與對(duì)照(子葉)之間存在極顯著差異(P<0.01)。**.Very significant difference between treatment and control(cotyledon) (P<0.01).

為了了解GhJAZ1基因激素響應(yīng)的表達(dá)特征，分別檢測(cè)了施加0.1 mmol/L ABA和0.1 mmol/L Me-JA處理0，1，3，6 h時(shí)中棉所36幼苗葉片中GhJAZ1基因的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果表明，ABA和MeJA處理后該基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，且都在處理1 h后表達(dá)量達(dá)到最高。不同的是，MeJA處理后GhJAZ1基因表達(dá)量急劇上升，1 h即達(dá)到對(duì)照的20倍。ABA處理后1 h，該基因的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的2.5倍，處理后6 h，該基因的表達(dá)量反而低于對(duì)照。

*.處理與對(duì)照(0 h)之間存在顯著差異(P<0.05)；**.處理與對(duì)照(0 h)之間存在極顯著差異(P<0.01)。*.Significant difference between treatment and control (0 h) (P <0.05)；**.Very significant difference between treatment and control (0 h) (P<0.01).

2.4 亞細(xì)胞定位

將空載質(zhì)粒pCAMBIA1302-GFP和融合表達(dá)載體pCAMBIA1302-GhJAZ1-GFP注射煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，培養(yǎng)2 d后，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖7)，從圖7可以看出，對(duì)照的GFP空載體的綠色熒光在整個(gè)細(xì)胞都能看到，為組成型表達(dá)；GhJAZ1-GFP融合表達(dá)蛋白只在細(xì)胞核中能看到綠色熒光，表明該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞核內(nèi)，這與生物信息分析預(yù)測(cè)的核定位信號(hào)的結(jié)果一致。

圖7 GhJAZ1亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of GhJAZ1

3 討論

JAZ蛋白作為E3泛素連接蛋白降解復(fù)合體SCFCOI1的靶蛋白，是茉莉素(JA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分，扮演著轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用[3，13]。已有研究表明，JAZ基因通過(guò)與bHLH類、MYC類和ICE1等蛋白互作，在JA信號(hào)通路中發(fā)揮作用[14-16]，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫響應(yīng)。Hu等[17]報(bào)道，擬南芥JAZ1和JAZ4能夠通過(guò)抑制ICE1對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而抑制ICE1下游基因CBF3的表達(dá)。

棉花的JAZ基因研究還比較少。本研究克隆了陸地棉GhJAZ1基因，該基因?qū)儆谥参锾赜械腡IFY基因家族，其編碼蛋白長(zhǎng)度為270個(gè)氨基酸殘基，分子量約29.808 ku，等電點(diǎn)pI約為8.33，是核定位蛋白。多序列比對(duì)表明，陸地棉GhJAZ1與其他植物的JAZ蛋白具有很高的相似性，都具有JAZ蛋白保守的TIFY結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域。從系統(tǒng)進(jìn)化分析可知，陸地棉與同是錦葵科的植物可可樹(shù)、黃麻聚為一類，親緣關(guān)系較近，說(shuō)明基因保守性很強(qiáng)。

JAZs不含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，必須依賴蛋白間的互作行使功能[1]。擬南芥的12個(gè)JAZ家族成員均含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即NT、TIFY(TIF[F/Y]XG)和Jas結(jié)構(gòu)域(SLX2FX2KRX2RX5PY)，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以與其他因子形成二聚體[18-19]。其中，N末端弱保守的NT結(jié)構(gòu)域可與DELLA蛋白互作[18]，TIFY結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)不同JAZs之間形成同源或異源二聚體[20]，Jas結(jié)構(gòu)域可以同MYC等很多蛋白互作[21]。已有研究表明，JAZ家族基因在植物抵御非生物脅迫中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用，但不同JAZ基因參與調(diào)節(jié)逆境響應(yīng)的方式可能不同[4，7]。本研究發(fā)現(xiàn)，GhJAZ1基因受ABA、MeJA和低溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，但脅迫表達(dá)方式存在差異，說(shuō)明GhJAZ1基因可能在逆境應(yīng)答中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，但不同逆境下該基因參與調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控的互作因子可能不同。Jas結(jié)構(gòu)域中存在細(xì)胞核定位信號(hào)，使JAZs具有核定位特性[22]。本研究的亞細(xì)胞定位結(jié)果也證實(shí)，GhJAZ1定位于細(xì)胞核中。GhJAZ1編碼的蛋白在細(xì)胞核中可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，通過(guò)激活或抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)調(diào)控該轉(zhuǎn)錄因子下游基因的表達(dá)。

本研究對(duì)GhJAZ1基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，可以初步推測(cè)GhJAZ1基因在棉花低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，這為后續(xù)研究基因功能和其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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