高新萍，石若冰，何海鵬，張 惠，劉 金，李雅釵，劉丹陽，梁義娟

子宮頸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病人群越來越年輕化，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。人類黑色素瘤相關(guān)抗原-A9(melanoma-associated antigen-A9,MAGE-A9)為MAGE-A基因家族的一員[1]。有研究[2]顯示MAGE-A9在多種腫瘤組織呈高表達(dá)，但在子宮頸癌中的表達(dá)研究報(bào)道尚少。此實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)檢測MAGE-A9在宮頸癌組織中的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測不同宮頸組織中MAGE-A9基因的表達(dá)，探討MAGE-A9在子宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1病例資料整理2012年6 月～2016 年6 月河北大學(xué)附屬醫(yī)院患者臨床資料。收集存檔蠟塊標(biāo)本，其中正常宮頸組織20例、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia， CIN)組織30例、宮頸癌組織69例，臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：ⅠA～ⅠB期50例、ⅡA期19例，年齡31～63歲，中位年齡52歲。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組中MAGE-A9表達(dá)及分布，記錄入組患者臨床病理參數(shù)及年齡。另收集本院手術(shù)切除的新鮮宮頸組織標(biāo)本。宮頸病變手術(shù)室取材的標(biāo)本是宮頸活檢明確診斷后行宮頸錐切術(shù)或子宮全切及廣泛子宮全切的的宮頸標(biāo)本，正常宮頸組織，選自因子宮良性病變切除全子宮患者(術(shù)前液基薄層學(xué)檢測未見異常)。將標(biāo)本置于EP管中，立刻放入液氮罐，盡快運(yùn)送至醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理。用組織剪將組織剪成約小塊，每個(gè)1.5 ml EP管分裝約100 mg組織，置于-80 ℃冰箱保存，分裝，避免反復(fù)凍融。運(yùn)用RT-qPCR檢測MAGE-A9基因的表達(dá)情況。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 將存檔石蠟包塊連續(xù)切片，厚度約4 mm，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ級(jí)脫蠟處理，經(jīng)無水乙醇Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)脫水，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，滴加適量3% H2O2，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，滴加一滴正常山羊血清封閉液(試劑A)，室溫放置15 min，每張切片滴加適當(dāng)稀釋的MAGE-A9一抗工作液約50 μl(上海Abcom貿(mào)易有限公司)；空白對(duì)照組滴加PBS液約50 μl，置于4 ℃冰箱過夜孵育。滴加適當(dāng)稀釋二抗50 μl(試劑B)，滴過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(試劑C)， DAB溶液顯色，光鏡下閱片。以胎盤組織做陽性對(duì)照。顯微鏡下觀察細(xì)胞核見棕黃色顆粒為 MAGE-A9 陽性細(xì)胞。

1.2.2RT-qPCR 將組織在液氮下磨碎，用TRIzol試劑盒提取RNA，紫外分光光度儀進(jìn)行RNA濃度和純度的測定，利用Pubmed查找基因的序列號(hào)，上海生科公司利用基因序列號(hào)合成相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物，MAGE-A3，上游引物序列：5′-GGGGGTGTATGTTGGGAAGG-3′；MAGE-A3下游引物序列：5′-GATGGGTAGCAGATGGGCTC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′，GAPDH下游引物序列：5′-AGGTCCACCACTACACGTTT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min，熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃、10 s，64 ℃、30 s，72 ℃、32 s，共40個(gè)循環(huán)。所取數(shù)據(jù)根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示，臨床病理學(xué)特征中的表達(dá)水平采用χ2檢驗(yàn)分析方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MAGE-A9在正常宮頸組織、CIN組織和早期宮頸癌組織中的表達(dá)情況MAGE-A9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少量表達(dá)細(xì)胞核中，呈淡黃色～棕褐色染色，MAGE-A9蛋白的染色強(qiáng)度隨著子宮頸病變程度的加重而增強(qiáng)。MAGE-A9在正常宮頸組織、CIN、早期宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為5.00%、13.33%、47.83%；正常宮頸組織中1例表達(dá)呈陽性、19例表達(dá)呈陰性；在CIN組織中4例表達(dá)呈陽性、26例表達(dá)呈陰性；在宮頸癌69例陽性中有33例表達(dá)呈陽性、36例表達(dá)呈陰性。宮頸癌組表達(dá)高于CIN組及正常宮頸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2MAGE-A9在早期宮頸癌組織中表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系MAGE-A9主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中也有少量表達(dá)。50例Ⅰ期患者標(biāo)本中陽性表達(dá)例數(shù)18例、陽性率為36.00%；而在19例ⅡA1 期患者標(biāo)本中，陽性表達(dá)例數(shù)15例、陽性率78.95%； MAGE-A9 在Ⅰ期、ⅡA1期陽性表達(dá)率依次增高；兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。同時(shí)MAGE-A9 的表達(dá)在G1、G2、G3 組陽性表達(dá)率分別為40.00%、35.48%、77.78%，隨著組織病理學(xué)的級(jí)別升高而增強(qiáng)，三組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中陽性表達(dá)率分別為80.00%，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。而年齡、病理類型之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

圖1 免疫組化法檢測不同程度的子宮頸病變組織中MAGE-A9蛋白的表達(dá) SP×200

A：正常子宮頸組織中，MAGE-A9蛋白染色為淡黃色呈陰性表達(dá)；B：CIN組織中，MAGE-A9蛋白染色為淡黃色，呈陰性表達(dá)；C：子宮頸癌組織中，MAGE-A9蛋白染色為淡黃色，呈陰性表達(dá)；D：子宮頸癌組織中，MAGE-A9蛋白染色為棕褐色，呈強(qiáng)陽性表達(dá)

表1 不同臨床病理指標(biāo)的子宮頸癌組織中MAGE-A9蛋白的表達(dá)比較

2.3RT-PCR檢測基因MAGE-A9的mRNA 水平結(jié)果顯示，正常宮頸組、CIN組、宮頸癌組的相對(duì)定量值分別為0.182 ±0.062、0.234±0.087與0.642±0.150，宮頸癌組與正常組及CIN組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常組與CIN組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 不同臨床病理指標(biāo)的子宮頸癌組織中MAGE-A9基因的表達(dá)比較

A：正常組織； B：CIN組織；C：宮頸癌組織； 與正常組織比較：*P<0.05；與CIN組織比較：#P<0.05

3 討論

MAGE是癌睪丸-抗原中研究較多的成員。第一個(gè)黑色素瘤相關(guān)抗原基因是在1991年由van der Bruggen et al[1]分離克隆的，命名為MAGE-1(后更名為MAGE-A1)。MAGE-A抗原在不同組織學(xué)來源和生殖細(xì)胞的多種癌癥中表達(dá)。由于其相對(duì)較高的腫瘤特異性，是目前癌癥免疫治療的有吸引力的靶標(biāo)[3]。MAGE-A9是MAGE家族的一員，MAGE-A9 cDNA全長945 bp，編碼的蛋白產(chǎn)物約315個(gè)氨基酸，分子量約35 ku。最近研究[4]顯示，MAGE-A9有可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究[5-6]顯示，MAGE-A9通常在泌尿系統(tǒng)腫瘤中過度表達(dá)，并且可以提供膀胱癌和腎細(xì)胞癌中的預(yù)后信息。此外，MAGE-A9在喉鱗狀細(xì)胞癌，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，人食管鱗狀細(xì)胞癌和肝癌中過表達(dá)[7-11]。

本研究中，使用免疫組化評(píng)價(jià)了宮頸癌組織中的MAGE-A9蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示47.83%的病例顯示MAGE-A9在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)。這與Zhai et al[12]在肺腺癌中的研究結(jié)果相一致。Gu et al[7]在對(duì)肝癌中MAGE-A9蛋白的表達(dá)量研究顯示，癌組織表達(dá)顯著高于非癌組織。同樣，曹克鑫 等[13]通過免疫組織化學(xué)法對(duì)食管鱗癌中 MAGE-A9的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MAGE-A9在食管鱗癌組織中表達(dá)率為50.94%。并且通過RT-qPCR研究結(jié)果顯示MAGE-A9基因在正常食管組織中低表達(dá),而在食管鱗癌組織中高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示宮頸癌組織中的MAGE-A9相對(duì)表達(dá)量明顯高于CIN及正常組織。

Liu et al[14]在對(duì)LSCC患者M(jìn)AGE-A9研究發(fā)現(xiàn)，46.2%患者M(jìn)AGE-A9呈高表達(dá)，結(jié)合臨床資料發(fā)現(xiàn)，MAGE-A9的表達(dá)與臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小相關(guān)。并且通過Cox的多變量分析顯示，MAGE-A9表達(dá)是LSCC患者獨(dú)立預(yù)后不良因素。此外，在肝癌中MAGE-A9蛋白的表達(dá)水平與病理分級(jí)、門靜脈侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)[7]。本研究顯示，MAGE-A9的高表達(dá)與病理分級(jí)臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、病理組織類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，Zhan et al[15]在對(duì)結(jié)直腸癌研究也發(fā)現(xiàn)MAGE-A9與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此推斷MAGE-A9可能參與了宮頸癌的浸潤與轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述， MAGE-A9在宮頸癌組織中表達(dá)異常增高，而在癌前病變及正常組織中呈低表達(dá)。通過與臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明，MAGE-A9蛋白的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移呈密切相關(guān)，通過對(duì)基因的檢測表明，MAGE-A9可能參與了宮頸癌的發(fā)生，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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