劉 偉，張建文

目的體外觀察阿帕替尼(APA)聯(lián)合放療對宮頸癌HeLa 細胞周期和凋亡影響。方法對數(shù)生長期HeLa細胞分為對照組、藥物組、放療組和聯(lián)合組。流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，分析放療后HeLa 細胞周期和凋亡變化。結(jié)果聯(lián)合組G0/G1期阻滯明顯高于對照組和放療組(P<0.05)。聯(lián)合組S期比例最低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與放療組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合組凋亡率高于對照組和藥物組(P<0.05)。結(jié)論APA聯(lián)合放療有明顯G0/G1期細胞周期阻滯作用，但無明顯凋亡誘導(dǎo)作用。

阿帕替尼；放療；細胞周期/凋亡；宮頸癌/HeLa細胞

宮頸癌是女性常見腫瘤之一，2010和2011年宮頸癌在中國癌癥中居第7和10位[1-2]。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期，ⅡB期以后患者占59.2%(45/76)[3]。放療是宮頸癌主要治療措施，單純放療具有較好療效，單純放療20年總生存率為77%(123/171)，高于根治性手術(shù)72%(123/172)，但仍有27.4% (94/343) 出現(xiàn)復(fù)發(fā)[4]。順鉑(cisplatin, DDP)是局部進展期宮頸癌同步放化療常用的藥物[5]，但嚴重的胃腸道反應(yīng)是限制其廣泛應(yīng)用的主要因素?？寡苌墒前⑴撂婺?apatinib，APA)主要作用機制，能有效、低毒地抑制肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等移植瘤模型的生長[6-7]。除抗血管生成外，APA是否影響細胞周期和凋亡尚不清楚，該研究主要體外觀察APA聯(lián)合放療對宮頸癌細胞周期和凋亡影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料APA (有效劑量0.425g/片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國HyClone公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；細胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；人宮頸癌HeLa細胞株(西南醫(yī)科大學(xué)腫瘤科實驗室提供)；直線加速器(瑞典醫(yī)科達公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞株(HeLa)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每天觀察細胞生長狀態(tài)，每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組和照射條件 實驗分為對照組、藥物組、放療組和聯(lián)合組。采用直線加速器照射，源皮距=100 cm，射野40 cm×40 cm，照射劑量2 Gy。

1.2.3APA藥物工作濃度的選取 在前期體外實驗研究中，顯示APA 對HeLa的增殖抑制呈濃度依賴性，半數(shù)抑制濃度為27.16 μmol/L，20%半數(shù)抑制濃度為11.46 μmol/L。選取APA(20%半數(shù)抑制濃度：11.46 μmol/L)作為實驗藥物濃度。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡 取對數(shù)生長期的HeLa細胞，吸取2 ml濃度為5×104/ml的HeLa細胞懸液加入35 mm培養(yǎng)皿中，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h(即細胞貼壁生長)后，藥物組和聯(lián)合組加入APA(11.46 μmol/L)，各組設(shè)3個平行樣本。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后對放療組和聯(lián)合組行2 Gy照射，照射后24 h終止培養(yǎng)。常規(guī)消化、離心、重懸，預(yù)冷PBS洗滌重懸細胞后70%酒精4 ℃固定過夜。次日再次離心沉淀細胞，離心棄固定液，每管細胞加入配制好的0.5 ml碘化吡啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。細胞凋亡檢測采用常規(guī)消化、離心、PBS重懸細胞后，再次離心細胞，吸去PBS，每管加入約100 μl binding buffer重懸細胞，然后分別加入7-AAD (5 μl)和PE(5 μl)，室溫下避光孵育15 min后，再加入400 μl binding buffer，輕輕吹打均勻，行流式細胞儀檢測細胞凋亡。以上實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1細胞周期分布聯(lián)合組(71.51±1.65)% G0/G1期比例高于對照組(57.25±0.92)%和放療組(59.38±2.24)% (P<0.05)，與藥物組(60.90±1.27)% 相似，對照組和放療組相似。聯(lián)合組(15.45±2.77)%與藥物組(13.37±1.40)%G2/M期相似，高于對照組(10.24±0.30)%，低于放療組(24.46±2.59)% (P<0.05)。聯(lián)合組(13.04±1.41)% S期比例最低，對照組 (32.50±0.98)%最高，其次為藥物組(25.74±2.56)%。見表1和圖1。

圖1 HeLa細胞周期分布 A：對照組；B：放療組；C：藥物組；D：聯(lián)合組

2.2細胞凋亡率聯(lián)合組凋亡率最高(5.81±0.21)%，其次為放療組(5.51±0.15)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組和放療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。藥物組凋亡率高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合組和放療組凋亡率均高于藥物組(P<0.05)。見表2和圖2。

表1 HeLa細胞周期分布情況

注：P1/P2與t1/t2分別表示與對照組、放療組比較的P值及t值；與對照組比較：*P<0.05；與放療組比較：#P<0.05

表2 HeLa細胞凋亡率

與對照組比較：*P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05；注：P1/t1、P2/t2、P3/t3分別表示與對照組、藥物組、放療組比較的P值及t值

圖2 HeLa細胞凋亡率分布

A：對照組；B：藥物組；C：放療組；D：聯(lián)合組；與對照組比較：*P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，抗血管生成治療是抗腫瘤治療的重要環(huán)境[8]。APA是一種新型酪氨酸激酶抑制劑，高度選擇作用于VEGFR-2的三磷酸腺苷酶結(jié)合位點，阻斷下游信號通路，抑制腫瘤血管生成。臨床應(yīng)用表明APA在肝癌等腫瘤治療中具有較好臨床療效，毒副作用發(fā)生率較低，無嚴重藥物相關(guān)不良事件發(fā)生[9]。除抗血管生成外，APA有無其他作用，宮頸癌APA聯(lián)合放療是否影響細胞周期分布和凋亡，缺乏相關(guān)研究，本實驗旨在體外研究APA聯(lián)合放療對宮頸癌HeLa細胞周期及凋亡的影響。

細胞周期中G2/M期對電離輻射最敏感，G1期相對敏感，S期呈放射抵抗[10]。不同抗血管生成藥物對細胞周期阻滯不同。在胃腸道腫瘤和肝癌中研究[11-12 ]顯示，索拉非尼、BD0801 或貝伐單抗有促進G0/G1期阻滯作用，在卵巢癌研究提示以G2/M期阻滯為主[13]。本研究結(jié)果顯示，APA聯(lián)合放療或單藥APA均以G0/G1期細胞阻滯為主(71.51±1.65)%和(60.90±1.27)%，APA聯(lián)合放療降低S期細胞比例(13.04±1.41)%，低于單純放療(16.16±1.70)%，單藥APA S期細胞比例仍較高(25.74±2.56)%。研究[11-12]顯示APA促進放療后HeLa細胞阻滯于G0/G1期，減少S期細胞比例。采用間斷給藥方式可能有增加HeLa細胞放射敏感性作用。

細胞凋亡是放療導(dǎo)致細胞死亡方式，不同分子靶向藥物聯(lián)合放療具有促凋亡作用。在乳腺癌及肺癌研究[14-15]顯示，吉非替尼聯(lián)合放療明顯增加乳腺癌及肺癌凋亡率。本研究表明，APA聯(lián)合放療明顯促進HeLa細胞凋亡率發(fā)生(5.81±0.21)%，比單純放療(5.51±0.15)%和單藥APA (3.14±0.84)%細胞凋亡率高，比單藥APA高近2倍，比對照組(1.52±0.74)%高近4倍。APA聯(lián)合放療與單純放療細胞凋亡率相似。上述結(jié)果提示單藥APA具有促凋亡作用，但聯(lián)合放療促凋亡作用表現(xiàn)不明顯，可能與APA作用機制有關(guān)，對調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白影響可能較小。

綜上所述，APA聯(lián)合放療具有細胞周期阻滯作用，以G0/G1期阻滯為主，在促凋亡方面，具有一定促凋亡作用，但作用不明顯，原因有待進一步研究。

[1] Chen W, Zheng R, Zeng H, et al. Annual report on status of cancer in China, 2011[J]. Chin J Cancer Res, 2015, 27(1): 2-12.

[2] Chen W, Zheng R, Zhang S, et al. Annual report on status of cancer in China, 2010[J]. Chin J Cancer Res, 2014, 26(1): 48-58.

[3] Lee J, Lin J B, Sun F J, et al. Safety and efficacy of semiextended field intensity-modulated radiation therapy and concurrent cisplatin in locally adva nced cervical cancer patients: An observational study of 10-year experience[J]. Medicine (Baltimore), 2017, 96(10): e6158.

[4] Landoni F, Colombo A, Milani R, et al. Randomized study between radical surgery and radiotherapy for the treatment of stage IB-IIAcervical cancer: 20-year update[J]. J Gynecol Oncol, 2017, 28(3): e34.

[5] Lin J F, Berger J L, Krivak T C, et al. Impact of facility volume on therapy and survival for locally advanced cervical cancer[J]. Gynecol Oncol, 2014, 132(2): 416-22.

[6] Tian S, Quan H, Xie C, et al. YN968D1 is a novel and selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor-2 tyrosine kinase with potent activityinvitroandinvivo[J]. Cancer Sci, 2011, 102(7): 1374-80.

[7] 粱 樹,童秀珍, 符立悟.小分子酪氨酸激酶抑制劑Apatinib對白血病HL-60細胞株抑制增殖作用及機制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,31(5):871-4.

[8] Zhao C, Su Y, Zhang J, et al. Fibrinogen-derived fibrinostatin inhibits tumor growth through anti-angiogenesis[J]. Cancer Sci, 2015, 106(11): 1596-606.

[9] Kou P, Zhang Y, Shao W, et al. Significant efficacy and well safety of apatinib in an advanced liver cancer patient: a case report and literature review[J]. Oncotarget, 2017, 8(12): 20510-5.

[10] Hufnagl A, Herr L, Friedrich T, et al. The link between cell-cycle dependent radiosensitivity and repair pathways: a model based on the local, sister -chromatid conformation dependent switch between NHEJ and HR[J].DNA Repair (Amst), 2015, 27: 28-39.

[11] Plastaras J P, Kim S H, Liu Y Y, et al.Cell cycle dependent and schedule-dependent antitumor effects of sorafenib combined with radiation[J]. Cancer Res, 2007, 67(19): 9443-54.

[12] Liu L, Qin S, Zheng Y, et al. Molecular targeting of VEGF/VEGFR signaling by the anti-VEGF monoclonal antibody BD0801 inhibits the growth and induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma cellsinvitroandinvivo[J]. Cancer Biol Ther, 2017, 18(3): 166-76.

[13] Momeny M, Sabourinejad Z, Zarrinrad G, et al. Anti-tumour activity of tivozanib, a pan-inhibitor of VEGF receptors, in therapy-resistant ovarian car cinoma cells[J]. Sci Rep, 2017, 7: 45954.

[14] Li P, Zhang Q, Torossian A, et al. Simultaneous inhibition of EGFR and PI3K enhances radiosensitivity in human breast cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2012, 83(3): e391-7.

[15] Sato Y, Ebara T, Sunaga N, et al. Interaction of radiation and gefitinib on a human lung cancer cell line with mutant EGFR geneinvitro[J]. Antica Ncer Res, 2012, 32(11): 4877-81.