喬婷婷,羅 淵, 陸承榮, 段連寧

自然殺傷(natural killer cell , NK)細胞是體內(nèi)重要的淋巴細胞亞群[1]，可直接通過釋放細胞毒性顆粒包括顆粒酶和穿孔素等途徑來殺傷腫瘤細胞?；罨腘K細胞在免疫治療中，對多種腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用[2]。而NK細胞在殺傷腫瘤細胞的同時，自身又發(fā)生了什么改變，細胞最后的歸宿如何，仍然不詳。

相關(guān)研究[3]表明紅白血病細胞系K562采用Fas激活性抗體CH11作用于NK細胞可以誘導活化的NK細胞凋亡，其作用機制可能與FasL/Fas途徑有關(guān)。近年，組蛋白H2A家族的一個分子H2AX， 因為參與細胞核內(nèi)DNA分子的損傷修復作用而引起人們的關(guān)注。大量報道[4-5]表明，H2AX的主要功能受控于其C末端第139位點絲氨酸磷酸化作用(Ser139) 。H2AX的磷酸化修飾也被命名為γH2AX。 H2AX除了參與DNA分子損傷修復作用外，還存在一種新的功能，即調(diào)亡調(diào)控[4]。對于其是否參與通過誘導NK細胞凋亡致使白血病免疫逃逸，該研究對NK細胞凋亡和H2AX磷酸化及其之間的關(guān)系進行檢測，初步探討H2AX是否參與白血病細胞誘導NK細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1主要試劑和器材造血干細胞α-MEM培養(yǎng)基[含12.5%新生牛血清、12.5%馬血清、100 U/ml rh 白介素(interleukin，IL)-2]；DMEM培養(yǎng)液購自美國HyClone公司；特級胎牛血清購自美國Gibco公司；Fas激活性抗體CH11、 PE AnnexinV凋亡檢測試劑盒和10×紅細胞裂解液均購自美國Bacton Dickinson公司；紅白血病細胞株K562由本實驗中心常規(guī)保存和傳代。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) ① NK-92細胞用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整純化的NK細胞密度為1×106/ml，每孔2 ml加于6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換1次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至培養(yǎng)皿中細胞數(shù)在80%左右開始實驗；② 白血病細胞K562培養(yǎng)用含5%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液按適當濃度置于25 cm2培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔48 h換1次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時開始實驗。

1.2.2實驗方法 ① 培養(yǎng)NK-92細胞，用Fas激活性抗體CH11模擬K562細胞系誘導凋亡，在不同CH11濃度(0、2.5、5、10、20 μg/ml)的培養(yǎng)條件下檢測細胞凋亡，該實驗至少重復3次；② 在Fas激活性抗體CH11不同濃度(0、5、10、40、80 μg/ml)分別培養(yǎng)后，收集每組細胞，檢測H2AX的磷酸化水平，該實驗至少重復3次。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測NK細胞凋亡 干細胞α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NK92細胞，加入Fas激活性抗體CH11，按照上述實驗方法用不同的濃度培養(yǎng)后，收集細胞上流式機檢測NK細胞凋亡。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測H2AX磷酸化 在用Fas激活性抗體CH11作用于NK92細胞的同時，收集不同濃度的細胞，重懸細胞使細胞密度達1×106～5×106cells/ml，37 ℃培養(yǎng)一段時間；取1×106個細胞/100 μl，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應30 min；室溫12 000 r/min離心4 min，棄上清液；100 μl PBS重懸細胞，再加入PE標記熒光二抗混勻，室溫下反應30 min：PBS再洗滌細胞2次，加入500 μl PBS重懸成單細胞懸液，上機檢測H2AX的磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1流式檢測K562細胞誘導活化NK92細胞的凋亡情況腫瘤細胞表面表達的Fas-L分子可以結(jié)合NK細胞表面的Fas受體，進而反向攻擊NK細胞。為了模擬腫瘤靶細胞對NK細胞的誘導作用，本研究使用anti-Fas激活性抗體激活Fas-L/Fas信號轉(zhuǎn)導通路，然后檢測NK細胞凋亡。結(jié)果表明，隨著Fas激活性抗體CH11濃度的增加，K562細胞誘導NK細胞凋亡的情況明顯增加，且隨著時間的增加凋亡的情況更加顯著并呈劑量依賴性。CH11不同濃度下，NK92細胞的凋亡情況與不加抗體相比較差異有統(tǒng)計學意義(F=159.8，P<0.05)。見圖1、2。

圖1 CH11不同濃度下，NK92細胞的凋亡情況 與不加抗體比較：*P<0.05，**P<0.001

2.2流式檢測H2AX磷酸化為了驗證anti-Fas 激活性抗體誘導NK細胞凋亡的同時，H2AX 是否也發(fā)生磷酸化作用，本研究通過間接熒光標記法對NK細胞內(nèi)磷酸化Ser139的H2AX 蛋白進行標記，然后用流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度值。結(jié)果表明，NK細胞H2AX磷酸化呈anti-Fas劑量依賴性，即隨著anti-Fas劑量的升高，NK細胞凋亡越來越顯著，同時H2AX的磷酸化水平也越來越強。不同濃度下H2AX的磷酸化情況與0 μg/ml濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=154.0，P<0.05)。見圖3、4。

圖2流式細胞術(shù)檢測不同CH11濃度下NK92細胞的凋亡

A:0 μg/ml; B:2.5 μg/ml;C:5 μg/ml;D:10 μg/ml;E:20 μg/ml

圖3 不同濃度下H2AX的磷酸化情況 與0濃度比較：*P<0.05，**P<0.001

3 討論

在體內(nèi)，NK細胞通過活化作用聚集并浸潤到腫瘤組織內(nèi)部及病灶周圍，起到殺傷腫瘤的作用[6]。另外NK細胞對從腫瘤組織內(nèi)新生的腫瘤細胞同樣具有明顯的殺傷作用[7]。其腫瘤殺傷效應機制研究較多，特別是NK細胞受體與靶細胞配體機制研究較為深入，即“Missing self”機制。然而NK細胞在執(zhí)行殺傷作用的同時，本身也受到腫瘤細胞的調(diào)控從而導致凋亡。

關(guān)于活化的NK細胞與腫瘤細胞相互作用后，NK細胞的存活及狀態(tài)如何，人們較少重視。Dempsey et al[8]利用NK細胞群與黑色素瘤細胞Fol在不同時間點共孵育，發(fā)現(xiàn)活化NK細胞在發(fā)揮殺傷活性后，自身也隨之凋亡。

相關(guān)的實驗結(jié)果也證實了這一點：隨著NK細胞與白血病細胞相互作用時間延長，NK的凋亡率顯著增加，表明IL-2激活的NK細胞與紅白血病細胞系K562相互作用時K562可以誘導NK細胞凋亡[9]。這也與文獻[1,10]的研究結(jié)果一致。本文結(jié)果顯示，隨著體系中CH11濃度的升高，細胞凋亡明顯增加，并呈劑量依賴性 。

抑癌蛋白H2AX是組蛋白家族H2A的一個變異分子，是細胞核內(nèi)基因組的保護蛋白。如果缺乏組蛋白H2AX，基因組的穩(wěn)定性就會減弱，使得正常細胞和組織對腫瘤易感性增加，因而被認為是一個腫瘤抑制因子或抑癌蛋白[11]。越來越多的證據(jù)表明，組蛋白H2AX調(diào)節(jié)腫瘤細胞調(diào)亡的功能與H2AX C末端磷酸化作用有關(guān)。相關(guān)研究[5]結(jié)果己經(jīng)證明，組蛋白H2AX在Ser139的磷酸化作用，在細胞調(diào)亡過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

本實驗結(jié)果表明隨著CH11濃度的升高，細胞凋亡明顯增加，并呈劑量依賴性，與此同時H2AX的磷酸化水平也隨逐步增高，并呈劑量依賴性。因此，在白血病K562細胞誘導活化的NK92細胞凋亡的過程中，H2AX的磷酸化是參與其中的可能機制。

圖4 流式細胞術(shù)檢測H2AX的磷酸化水平 A：0 μg/ml；B:5 μg/ml;C:10 μg/ml ;D:20 μg/ml;E:40 μg/ml;F:80 μg/ml

結(jié)合前期研究[3,6]，表明Fas/Fas-L與H2AX共同參與白血病誘導NK細胞凋亡。但是，H2AX的磷酸化作用是如何調(diào)控編輯凋亡途徑的尚需深入研究。

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