范璐璐，孫國平，查麗霞，馬 泰

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，據(jù)最新統(tǒng)計，全世界新發(fā)肝癌患者每年約 60 萬，居惡性腫瘤的第5位 ，肝癌因此被稱為“腫瘤之王”[1-2]。有文獻[3-4]報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導的凋亡抵抗是肝癌化療耐藥的重要原因之一，因此闡明肝癌凋亡抵抗的機制，進而發(fā)現(xiàn)新的干預手段提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，最終達到延長患者生存期的作用。丹皮酚具有如解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等廣泛的藥理作用[5-6]。許多文獻[7-9]報道了丹皮酚有抗腫瘤作用，其殺傷腫瘤細胞的主要機制是誘導凋亡，為了探討丹皮酚在ERS誘導HepG2肝癌細胞凋亡抵抗中的作用及機制，該研究首先通過觀察ERS誘導劑衣霉素(tunicamycin,TM)對人肝細胞(HL-7702)及肝癌細胞HepG2細胞的增殖抑制、凋亡差異及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表達的影響探討ERS凋亡抵抗的機制，通過使用丹皮酚觀察ERS下的HepG2肝癌細胞的增殖抑制、凋亡及COX-2蛋白表達影響，進而探討丹皮酚逆轉(zhuǎn)ERS誘導的HepG2肝癌細胞凋亡抵抗的機制。

1 材料與方法

1.1試劑及藥物塞來昔布、MTT 購自美國 Sigma 公司；丹皮酚注射劑購自上海第一制藥廠；DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 生物公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司；原位末端凋亡檢測試(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)劑盒購自美國羅氏公司；兔抗人COX-2、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(78 kD glucose regulated protein，GRP78)抗體購自美國 Santa Cruz 公司；鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔、抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器EL301 Strip reader酶標儀 (美國 Bio-Tek公司)；YJ-1450 型醫(yī)學凈化工作臺(蘇州凈化設備公司)； Image QuantTMLAS-4000 型發(fā)光成像系統(tǒng)(日本通用電氣醫(yī)療集團生命科學部)；DYY-10(ECP3000) 電泳儀(北京六一儀器廠)；倒置式顯微鏡(日本Olympus光 學 工 業(yè) 株 式 會 社)；Nacpo-6100 CO2培養(yǎng)箱(美國杜邦公司)。

1.3細胞系HL-7702人肝細胞株和HepG2人肝癌細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng)方法 使用含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，將細胞放置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2細胞增殖抑制實驗 將1×104/L細胞接種于96孔板上，設置空白對照組和細胞對照組、不同藥物組，每組設6個復孔，每孔接種200 μl細胞，置96孔板于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱24 h后，棄上清液，藥物組中每個孔加入使用200 μl DMEM稀釋的不同濃度的藥物，空白對照組和細胞對照組只加入200 μl的DMEM培養(yǎng)，在結(jié)束培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μl MTT 5 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每個孔加入150 μl的 DMSO，使用EL301 Strip reader酶標儀設定570 nm測定吸光值。按以下公式計算藥物對細胞的增殖抑制率：細胞的增殖抑制率(%)=(1-實驗組吸光值/細胞組吸光值)×100%。

1.4.3TUNEL 將1×105/L細胞接種于含有蓋玻片的6孔板中，置6孔板于37 ℃ 、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入不同濃度的藥物作用細胞24 h，取出6孔板中的蓋玻片，實驗同時設置陽性對照組和陰性對照組，使用4%多聚甲醛固定30 min 后，按照TUNEL試劑盒說明書操作，使用DAB顯色及蘇木精染色后封片。在普通光鏡下觀察TUNEL染色標本，隨機選取6個高倍視野，計算凋亡細胞占腫瘤細胞的比例即為凋亡指數(shù)。

1.4.4Western blot法 將細胞加入裂解液裂解30 min后離心，吸取上清液并使用Lorry法定量后加入蛋白上樣緩沖液，將樣本放入沸水煮10 min后將標本置于-20 ℃冰箱保存；實驗經(jīng)過電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后將標本孵育一抗并放置于4 ℃冰箱過夜。次日，將標本孵育二抗2 h再加入ECL化學發(fā)光試劑，利用發(fā)光成像系統(tǒng)顯像，以目標蛋白/β-actin值反映目標蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1ERS誘導劑TM對HepG2肝癌細胞和HL-7702肝細胞的增殖抑制及凋亡作用使用MTT法觀察不同濃度TM(1.5、3、6、9、12 μmol/L)分別作用于HepG2肝癌細胞和HL-7702肝細胞24 h的增殖抑制率(圖1)，結(jié)果顯示在TM誘導的ERS作用下肝癌細胞HepG2的增殖抑制率并無明顯增加，3 μmol/L TM作用24 h增殖抑制率僅達到(22.7±4.1)%，而HL-7702正常肝細胞在相同濃度TM的作用下抑制率為(61.1±3.5)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=-12.444，P<0.01)。采用TUNEL染色法觀察3 μmol/L TM分別作用于HepG2和HL-7702細胞24 h后細胞形態(tài)學變化(圖2A、B)，結(jié)果顯示HepG2肝癌細胞組中，未使用TM處理的肝癌細胞組細胞增殖旺盛，僅見少許的凋亡細胞；而使用TM 作用24 h的HepG2肝癌細胞，僅見細胞密度稍減少和少量的凋亡細胞，凋亡率(15.2±2.3)%；而在HL-7702細胞組中， TM處理組的HL-7702細胞密度增加，胞凋亡細胞數(shù)明顯增加,凋亡率(57.2±5.6)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=-12.201，P<0.01)，提示與正常HL-7702肝細胞相比，肝癌細胞HepG2對ERS誘導的細胞凋亡相對耐受。

圖1 TM誘導的ERS對HepG2和HL-7702細胞的增殖抑制率的影響

圖2 TM誘導的ERS對HepG2和HL-7702細胞凋亡的影響

A：TM作用于HepG2和HL-7702細胞的凋亡的形態(tài)學變化(TUNEL法×400)；B：TM作用于HepG2和HL-7702細胞的凋亡率；1：未處理HL-7702 組；2： TM 處理的HL-7702組；3：未處理HepG2組；4：TM 處理的HepG2組；與未處理組 HL-7702組比較：**P<0.01；與未處理HepG2組比較：##P<0.01；與TM處理的 HL-7702組比較：△△P<0.01

2.2ERS誘導劑TM對HL-7702肝細胞和HepG2肝癌細胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達的影響使用 Western bolt觀察3 μmol/L TM作用于HL-7702肝細胞和HepG2肝癌細胞24 h后COX-2蛋白和GRP78蛋白表達的影響(圖3)，結(jié)果顯示在HL-7702肝細胞和HepG2肝癌細胞中ERS標志性蛋白GRP78的表達均隨著TM作用時間的延長而其表達逐漸增多，表明ERS的產(chǎn)生。同時顯示，肝癌細胞HepG2在TM的作用下COX-2蛋白的表達隨著時間的延長而表達逐漸增加(P<0.05)，而在HL-7702細胞中， COX-2的表達并沒有相應增多，表明ERS可誘導HepG2肝癌細胞COX-2的表達，而不誘導正常肝細胞HL-7702 COX-2的表達。

2.3COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對TM誘導的HepG2肝癌細胞的COX-2表達的及凋亡作用Western bolt法觀察10 μmol/L COX-2選擇性抑制劑塞來昔布加入TM處理的HepG2細胞24 h后COX-2表達的變化(圖4A)， 結(jié)果顯示TM誘導HepG2肝癌細胞產(chǎn)生的COX-2可被塞來昔布抑制，采用TUNEL染色法觀察10 μmol/L COX-2選擇性抑制劑塞來昔布加入TM處理的HepG2肝癌細胞24 h后細胞凋亡的變化(圖4B、C)，結(jié)果顯示，與單獨使用TM組相比，塞來昔布加入TM處理的HepG2肝癌細胞后，細胞密度明顯減少，細胞凋亡率為(67.6±7.6)%(t=-11.418，P<0.01)。提示COX-2可能在ERS誘導的HepG2肝癌細胞凋亡抵抗中起重要作用。

2.4丹皮酚對ERS下的HepG2肝癌細胞的凋亡作用采用TUNEL染色法觀察31.25 mg/L丹皮酚加入TM處理的HepG2肝癌細胞24 h后細胞凋亡的變化(圖5A、B)，結(jié)果顯示，與單獨使用TM組相比，丹皮酚加入TM處理的HepG2肝癌細胞后，細胞密度減少，細胞凋亡率為(41.6±6.9)%(t=-4.647，P<0.01)，表明了丹皮酚可以逆轉(zhuǎn)ERS誘導的HepG2肝癌細胞的凋亡抵抗。

2.5丹皮酚對TM誘導的HepG2肝癌細胞COX-2表達的影響使用Western blot法檢測丹皮酚對TM誘導的HepG2肝癌細胞COX-2蛋白表達變化的影響(圖6)。結(jié)果顯示與未處理組相比，TM處理的肝癌細胞系HepG2 COX-2的表達明顯增高(P<0.01)，與TM組相比，使用丹皮酚明顯下調(diào)了ERS誘導的COX-2的表達(P<0.01)，表明丹皮酚可通過抑制COX-2逆轉(zhuǎn)ERS誘導的凋亡抵抗。

圖3 TM誘導的ERS對HL-7702肝細胞和HepG2肝癌細胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達的影響

A：TM對HL-7702肝細胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達的影響；B：TM對HepG2肝癌細胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達的影響；與未處理HL-7702 GRP78蛋白的比較：*P<0.05；與未處理HepG2組GRP78蛋白的比較：##P<0.01；與未處理HepG2組COX-2蛋白的比較：△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞重要的膜性細胞器，其是細胞內(nèi)糖類、脂類和蛋白質(zhì)合成及修飾的場所。當各種生理和病理因素造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白增加、鈣離子濃度改變，從而誘導ERS的發(fā)生[10]。對于實體瘤，由于營養(yǎng)條件和血液供應不足等因素的影響，可導致實體瘤內(nèi)存在低糖及低氧等應激環(huán)境，從而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，繼而誘發(fā)腫瘤細胞產(chǎn)生ERS[11]。ERS可激活未折疊蛋白反應，未折疊蛋白反應一方面其在一定程度上能夠緩解ERS帶來的相關(guān)損害；另一方面如果ERS持續(xù)并且過度，那么未折疊蛋白反應也可以誘導細胞凋亡。如果這種強ERS效應發(fā)生在腫瘤細胞身上，則可以誘導腫瘤細胞凋亡，進而達到抑制腫瘤的效應。因此，提高腫瘤細胞對ERS介導的凋亡的敏感性，是一種治療腫瘤的新策略。但有研究[12-13]指出，即使使用了ERS誘導劑，腫瘤細胞凋亡也并未有明顯的增多，這表明腫瘤細胞可對ERS產(chǎn)生適應從而逃避凋亡。本研究也顯示與正常人肝細胞株HL-7702相比，人肝癌細胞株HepG2在TM誘導的ERS作用下細胞的增殖抑制作用及凋亡作用并不明顯，這一結(jié)果顯示肝癌細胞HepG2對ERS誘導的細胞凋亡相對耐受。 目前關(guān)于其機制尚不清楚，因此闡明肝癌細胞ERS性凋亡抵抗的機制，通過新的干預手段提高肝癌對化療藥物的敏感性，最終達到延長患者生存時間的作用。

圖4 塞來昔布對TM誘導的HepG2肝癌細胞的COX-2表達的影響及凋亡作用

A：塞來昔布對TM誘導的HepG2細胞的COX-2表達的影響 ；B：塞來昔布作用于TM誘導的HepG2細胞的凋亡形態(tài)學變化 (TUNEL法×400)；C塞來昔布作用于TM誘導的HepG2細胞的凋亡率；1: 空白對照組;2 TM處理組;3：TM聯(lián)合塞來昔布處理組；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與TM處理組比較 ：##P< 0.01

圖5丹皮酚對ERS下的HepG2肝癌細胞的增殖抑制及凋亡作用

A：丹皮酚作用于TM誘導的HepG2肝癌細胞的凋亡形態(tài)學變化 (TUNEL法×400)；B：塞來昔布作用于TM誘導的HepG2肝癌細胞的凋亡率；1：空白對照組；2：TM 處理組；3：TM聯(lián)合Paeonol組；與空白對照組比較：**P< 0.01 ；與TM處理組比較：##P< 0.01

圖6 丹皮酚對TM誘導的HepG2肝癌細胞COX-2表達的影響

1：空白對照組；2：TM處理組；3：TM聯(lián)合Paeonol組；與空白對照組比較：**P<0.01；與TM處理組比較：##P<0.01

COX-2是前列腺素合成中的重要的限速酶，其在正常生理狀態(tài)下的多數(shù)組織中并不表達，但在細胞內(nèi)外刺激物(如內(nèi)毒素、細胞因子等)廣泛刺激下COX-2會迅速產(chǎn)生。研究[14-15]顯示COX-2可以促進腫瘤轉(zhuǎn)移、參與血管形成以及抵抗腫瘤細胞凋亡等，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究顯示使用ERS誘導劑TM作用于HL-7702正常肝細胞株和HepG2肝癌細胞株，分別于0、6、12、24 h觀察COX-2的表達變化，表明COX-2蛋白在肝癌細胞中明顯增多，而在正常肝細胞中未見COX-2的表達明顯增加，當加入COX-2選擇性抑制劑塞來昔布后肝癌細胞凋亡率上升，表明ERS 可以誘導肝癌細胞COX-2的表達，進而逃避了ERS介導的凋亡，抑制COX-2蛋白的表達可提高肝癌細胞HepG2對ERS性凋亡的敏感性，提示COX-2可能在ERS誘導的HepG2肝癌細胞凋亡抵抗中扮演著重要角色。

丹皮酚又稱為牡丹酚，是蘿摩科植物徐長卿全草和中藥芍藥科植物牡丹根皮的主要成分[5-6]。許多文獻[7-8]報道丹皮酚具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。不僅如此，不斷有研究[9]表明丹皮酚有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。本研究顯示丹皮酚加入TM處理的HepG2肝癌細胞后，增殖抑制及凋亡均明顯增加，表明丹皮酚可逆轉(zhuǎn)ERS誘導HepG2肝癌細胞凋亡抵抗。為明確丹皮酚是否通過抑制COX-2逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對ERS誘導的抵抗，利用Western blot技術(shù)顯示丹皮酚可下調(diào)ERS誘導的HepG2肝癌細胞的COX-2的表達，其結(jié)果與使用塞來昔布結(jié)果相似，表明丹皮酚可通過抑制COX-2蛋白的表達繼而逆轉(zhuǎn)ERS誘導的肝癌細胞HepG2的凋亡抵抗。

綜上所述，ERS誘導COX-2的產(chǎn)生可能是肝癌細胞HepG2抵抗細胞凋亡的原因之一，而丹皮酚可通過下調(diào)COX-2逆轉(zhuǎn)ERS誘導的HepG2肝癌細胞凋亡抵抗，從而深化了肝癌細胞對ERS性凋亡抵抗機制的認識，并為肝癌的治療提供新思路。

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