張傳海，桂 陽*，郭鳳林，馬金良，余繼海

microRNA是一類約22個(gè)堿基的小分子非編碼RNA，對細(xì)胞的增殖、分化具有重要的調(diào)控作用，已成為近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。microRNA通常與下游靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)結(jié)合，從而促使靶基因降解或抑制其翻譯，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[1-2]。肝癌以其惡性程度高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)成為臨床治療當(dāng)中的難題，尤其是其轉(zhuǎn)移機(jī)制目前還不是十分清楚。該課題旨在通過研究miR-7對肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響及作用機(jī)制，為深入探討其在肝癌中的作用奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制及臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料肝癌細(xì)胞株MHCC-97購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；pRL-TK載體購自上海林淵生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、β-鏈蛋白(β-catenin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗體購自美國Santa Cruz公司；表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)、p-EGFR抗體購自美國Bioworld公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；PCR引物購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MHCC-97H細(xì)胞快速復(fù)蘇后，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，使用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液、觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞匯合度約為90%時(shí)，進(jìn)行消化、傳代、種板，按1×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為80%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2載體構(gòu)建 miR-7真核載體(GV268/miR-7)、野生型和突變型EGFR 3’-UTR熒光素酶載體(GV272/ EGFR 3’-UTR wt和GV272/ EGFR 3’-UTR mu)，均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，經(jīng)鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞匯合度約為90%時(shí)，進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，按1×105/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為80%時(shí)，更換培養(yǎng)基為無血清、無抗生素培養(yǎng)基，使用Lipofectamine 2000并參考其說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4Real-time PCR 預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，參照RNA和microRNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA和microRNA。以總RNA和microRNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，使用ABI7500 Real-time PCR儀檢測相關(guān)基因的表達(dá)。MiR-7和U6引物序列分別為：上游引物 ：5′-TGGAAGACTAGTGATT-3′和上游引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物為通用引物；Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、15 min；95 ℃、20 s；60 ℃、34 s，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較分析miR-7表達(dá)。E-cadherin上游引物：5′-TCGCTTACACCATCCTCAGC-3′， 下游引物：5′-GGAAACTCTCTCGGTCCAGC-3′；β-catenin上游引物：5′-ACCACAAGCAGAGTGCTGAA-3′， 下游引物：5′-GCTTGCATTCCACCAGCTTC-3′；N-cadherin上游引物：5′-AACAGCAACGACGGGTTAGT-3′， 下游引物：5′-CAGACACGGTTGCAGTTGAC-3′；Vimentin上游引物：5′-AGGCGAGGAGAGCAGGATTT-3′， 下游引物：5′-AGTGGGTATCAACCAGAGGGA-3′；EGFR上游引物：5′-CGAATGGGCCTAAGATCCCG-3′，下游引物：5′-AGCTTGGTTGGGAGCTTCTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3′，下游引物：5′-TACGACCAAATCCGTTGACTCC-3′；Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、15 s；60 ℃、1 min，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較分析各基因表達(dá)。

1.2.5Western blot RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后，按50 μg/孔的量加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗膜3 min。各蛋白抗體分別參考抗體說明書進(jìn)行操作，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光、顯影，以GAPDH為內(nèi)參，分析各指標(biāo)的相對表達(dá)量。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將H293T細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，當(dāng)80%的細(xì)胞融合時(shí)，利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染(含有GV268/miR-7+野生型或突變型GV272/EGFR 3’UTR)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，以海腎熒光素酶載體(pRL-TK)作為參照，化學(xué)發(fā)光儀檢測、分析各組螢火蟲熒光素酶活性變化，判定miR-7是否與EGFR 3’UTR結(jié)合。

1.2.7細(xì)胞劃痕 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，加入RPMI 1640培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×106/孔種入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層即棄去培養(yǎng)液，用? 1.0 μm的劃痕器在每孔中央劃出一劃痕，無菌PBS洗去脫落細(xì)胞，100倍光學(xué)顯微鏡下拍照，即為0 h。然后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，在同一觀察點(diǎn)處進(jìn)行拍照、記錄細(xì)胞生長情況。利用Image Pro Plus 6.0軟件測量每孔多個(gè)點(diǎn)劃痕間距，取平均值，計(jì)算遷移率，即細(xì)胞遷移率(%)=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h/48 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.2.8Transwell實(shí)驗(yàn) 胰酶消化細(xì)胞后，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸、調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔1×104個(gè)的細(xì)胞密度加入到預(yù)鋪好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室的上室內(nèi)，下室加入500 ml完全培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出上室，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色1 min，蒸餾水清洗3次，每次3 min。以正常組作為對照，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野。

1.3實(shí)驗(yàn)分組本研究共分為2部分，第一部分miR-7對MHCC-97H細(xì)胞EMT的影響，分組為正常組、轉(zhuǎn)染GV268組和轉(zhuǎn)染GV268/miR-7組，分別標(biāo)記為Normal、GV268和GV268/miR-7；第二部分為miR-7對EGFR 3’-UTR及EGFR表達(dá)的影響，分組為正常組、轉(zhuǎn)染GV272/EGFR 3’-UTR wt和GV272/EGFR 3’-UTR mu組，分別標(biāo)記為Normal、GV272/EGFR 3’-UTR wt和GV272/EGFR 3’-UTR mu。

2 結(jié)果

2.1載體構(gòu)建結(jié)果經(jīng)測序鑒定GV268/miR-7、GV272/ EGFR 3’-UTR wt和GV272/ EGFR 3’-UTR mu序列均與設(shè)計(jì)序列一致，無堿基突變，表明構(gòu)建成功。見圖1。

2.2miR-7對MHCC-97細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell結(jié)果顯示，與Normal組相比，GV268/miR-7組細(xì)胞失去MHCC-97H細(xì)胞的基本形態(tài)，呈不規(guī)則形，且穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量顯著下降(F=2.595，P=0.000)，細(xì)胞侵襲能力為正常組的(41.82±11.28)%。見圖2。

圖1 載體測序比對結(jié)果

2.3miR-7對MHCC-97細(xì)胞遷移能力的影響與Normal組相比，GV268/miR-7組細(xì)胞24、48 h的遷移能力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.082、2.790，P=0.002、0.000)，其遷移力分別降低(32.19±9.15)%和(45.67±10.07)%。見圖3。

2.4miR-7對EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)蛋白的影響Real-time PCR和Western blot分析結(jié)果顯示，與正常組相比，轉(zhuǎn)染GV268/miR-7組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(F=12.740、1.241，P=0.000、0.001)，β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(F=55.870、1.550，P=0.000、0.000)，N-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(F=30.570、1.257，P=0.000、0.001)，Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(F=42.710、3.600，P=0.000、0.000)。見圖4。

圖2 miR-7對MHCC-97細(xì)胞侵襲能力的影響

A：不同組別細(xì)胞穿透Transwell小室的蘇木精染色結(jié)果(×200)；B：不同組別穿透Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量；C：不同組別細(xì)胞侵襲能力比較分析；與Normal組比較：**P<0.01

圖3 miR-7對MHCC-97細(xì)胞遷移能力的影響

A：細(xì)胞劃痕檢測不同組別細(xì)胞的遷移情況(×100)；B：不同組別細(xì)胞遷移能力的比較分析；與Normal組比較：**P<0.01

2.5miR-7對EGFR和p-EGFR表達(dá)的影響與Normal組相比，GV268/miR-7組EGFR mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降(F=4.602、2.196，P=0.000、0.002)，p-EGFR蛋白表達(dá)也顯著降低(F=3.707，P=0.003)表明miR-7可抑制EGFR和p-EGFR的表達(dá)。見圖5。

2.6miR-7對EGFR3’-UTR活性的影響雙熒光素酶活性檢測分析結(jié)果顯示：與GV268/miR-7+GV272相比，GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTRwt組熒光素酶活性顯著降低(F=1.690，P=0.000)，而GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR mu組熒光素酶活性無明顯變化，表明miR-7與EGFR 3’-UTR區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)，且二者可以結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)位于EGFR 3’-UTR區(qū)域內(nèi)，序列為：GTCTTCCA。見圖6。

3 討論

肝癌以惡性程度高、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、預(yù)后差成為了臨床治療的難題，而如何降低肝癌轉(zhuǎn)移能力成為急需解決的問題。近年來的研究[3]表明，EMT與肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移關(guān)系密切，并且課題組前期的研究[4]也已經(jīng)證實(shí)。EMT是指上皮細(xì)胞的生物過程通過特定程序轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，其在胚胎發(fā)育、慢性炎癥反應(yīng)、癌癥轉(zhuǎn)移發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5-7]。EMT發(fā)生的主要標(biāo)志為上皮標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin的減少和間質(zhì)標(biāo)記物E-cadherin和β-catenin的增加[8-10]。其通過表達(dá)更具有侵入性的蛋白酶，減弱腫瘤細(xì)胞間的黏附能力，使得腫瘤細(xì)胞具有運(yùn)動(dòng)活性，增加遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力和形成轉(zhuǎn)移灶。據(jù)報(bào)道[11-12]，一些miRNA如miR-7、miR-200、miR-429、miR-141可以促進(jìn)或抑制癌癥轉(zhuǎn)移和通過調(diào)節(jié)EMT的侵襲。

圖4 miR-7對MHCC-97H細(xì)胞EMT標(biāo)識(shí)基因表達(dá)的影響

A：miR-7對EMT標(biāo)識(shí)基因mRNA表達(dá)水平的影響；B：Western blot檢測miR-7對EMT標(biāo)識(shí)蛋白表達(dá)的影響；C：miR-7對EMT標(biāo)識(shí)蛋白表達(dá)水平的影響；與Normal組比較：**P<0.01

圖5 miR-7對EGFR和p-EGFR表達(dá)的影響

A：miR-7對EGFR mRNA表達(dá)水平的影響；B：Western blot檢測miR-7對EGFR和p-EGFR蛋白的影響；C：miR-7對EGFR和p-EGFR蛋白表達(dá)影響的分析；與Normal組比較：**P<0.01

圖6 miR-7對EGFR 3’-UTR螢火蟲熒光素酶活性的影響

1：轉(zhuǎn)染GV272組；2：轉(zhuǎn)染GV272+GV268/miR-7組；3：轉(zhuǎn)染GV268+GV272/EGFR 3’-UTR wt組；4：轉(zhuǎn)染GV268+GV272/EGFR 3’-UTR mu組；5：轉(zhuǎn)染GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR wt組；6：轉(zhuǎn)染GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR mu組；與轉(zhuǎn)染GV268+GV272/EGFR 3’-UTR wt組比較：**P<0.01；與轉(zhuǎn)染GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR mu組比較：##P<0.01

miR-7作為腫瘤抑制性微小RNA首先在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中被鑒定出來，其可通過靶向調(diào)控PAK1和EGFR信號(hào)通路抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長和侵襲[13-14]。研究[15-16]表明，miR-7在乳腺、舌、胃、肺和肝等腫瘤組織中下調(diào)。雖然許多研究[17-18]報(bào)道了miR-7的作用，但是其對肝癌細(xì)胞EMT的影響及作用機(jī)制研究的較少。因此，本研究運(yùn)用Real-time PCR、Western blot和免疫組化，驗(yàn)證了過表達(dá)miR-7可降低MHCC-97H細(xì)胞的侵襲、遷移能力，提高上皮標(biāo)識(shí)蛋白E-cadherin和β-catenin的表達(dá)，降低間質(zhì)標(biāo)識(shí)蛋白N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，進(jìn)而抑制MHCC-97H細(xì)胞EMT。

EGFR具有酪氨酸激酶受體家族的基本生物學(xué)功能，包括調(diào)控細(xì)胞活性、增殖、遷移和分化等，EGFR突變或過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[19]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測，通過構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體，證明了miR-7可直接靶向調(diào)控EGFR，抑制EGFR及p-EGFR表達(dá)，進(jìn)而降低MHCC-97H細(xì)胞的侵襲、遷移能力，初步闡明了miR-7調(diào)控MHCC-97細(xì)胞EMT的作用機(jī)制，為深入研究其對MHCC-97細(xì)胞的影響奠定了基礎(chǔ)。然而，由于miR-7作用途徑的多樣性，后期本研究將通過更加深入、廣泛的研究，進(jìn)一步闡述其在肝癌中的生物學(xué)功能。

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