鄧谷霖，李萬平，殷 杰，李曉冰，張 紅，孫玉紅

目的觀察卡托普利對大鼠非酒精性脂肪肝的作用及其氧化應(yīng)激的影響。方法將78只雄性SD大鼠隨機分為6組，正常組給予普通飼料；其余組(包括模型組)給予高脂飼料，造模6周后，將卡托普利高、中、低劑量組和羅格列酮組分別給予等體積高、中、低劑量卡托普利和羅格列酮；給予正常組和模型組等體積蒸餾水，6周后取血做血生化檢測及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)測定；取肝臟稱重，計算肝臟指數(shù)；取相同部位的肝組織勻漿測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)；另取肝組織固定做病理檢查；其余液氮固定測定CYP2E1 mRNA。結(jié)果模型組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、TC、TG、MDA、肝指數(shù)、CYP2E1 mRNA表達水平均增高，GSH含量下降；卡托普利高劑量組ALT、AST、TC、TG、MDA、肝指數(shù)、CYP2E1 mRNA表達水平均降低(P<0.05)，GSH含量升高(P<0.05)。肝臟病理學(xué)檢查顯示模型組可見肝細胞廣泛發(fā)生脂肪變性及炎癥反應(yīng)，卡托普利高劑量組肝細胞脂肪變性與炎癥程度明顯減輕。結(jié)論卡托普利可增強抗氧化應(yīng)激能力，減輕肝細胞脂肪變性，對非酒精性脂肪肝有一定的防治作用。

非酒精性脂肪肝；卡托普利；氧化應(yīng)激；高脂飲食

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)疾病譜包括非酒精性肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至是肝癌[1]，其發(fā)病率在發(fā)達國家成年人中已增加到30%，且仍在繼續(xù)上升[2]。NAFLD發(fā)生機制以氧化應(yīng)激為主，還包括肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體脂肪酸氧化功能障礙等[3]。氧化應(yīng)激是指人體在受到外界刺激時，高活性分子產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去均衡，從而導(dǎo)致組織受損[4]。改變生活方式和避免攝入損肝藥物是NAFLD的主要治療方法，但療效并不明顯。而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑-卡托普利在機體抗氧化應(yīng)激方面表現(xiàn)出良好的效果[5]，該文旨在觀察卡托普利對非酒精性脂肪肝的防治作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 健康雄性SD大鼠78只，SPF級，平均體重約130 g，由重慶騰鑫生物有限公司提供，合格證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.1.2試劑與藥品 飼料級膽固醇(批號：20130407)、飼料級膽酸鈉(批號：20130327)購自安徽天啟化工科技公司；三酰甘油(total glycerol，TG)測定試劑盒(批號：2013060003)、總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒(批號：2013030053)購自浙江東甌診斷產(chǎn)品公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒(批號：20130628)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(批號：20130629)購自南京建成研究所；CYP2E1引物(批號：8402634571、8402634572)購自上海生工生物工程公司；羅格列酮片(批號：121007)購自成都恒瑞制藥公司；卡托普利片(批號：121103)購自汕頭金石制藥廠。

1.1.3主要儀器 Thermo超低溫冰箱(720型) 購自美國ThermoScientific公司；Gel DocTM EZ成像系統(tǒng)購自美國伯樂BIO-RAD公司；ST16R臺式高速冷凍離心機購自上海賽默飛世爾科技有限公司；722N型分光光度計購自紹興市杰聯(lián)儀器有限公司；SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司；制冰機(SIM-F124)購自日本三洋公司。

1.2方法

1.2.1分組、造模與給藥 將78只雄性SD大鼠隨機分為6組：正常組給予普通飼料喂食；其余組(包括模型組)給予高脂飼料(87.8%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂食，造模6周確認大鼠脂肪肝模型建立后，將卡托普利高、中、低劑量組和羅格列酮組(統(tǒng)稱實驗組)分別給予高、中、低劑量卡托普利和羅格列酮溶于水后等體積喂食；給予正常組和模型組等體積蒸餾水，給藥6周。卡托普利中劑量組和羅格列酮組按體表面積相對比值計算用藥量，卡托普利高劑量組、卡托普利低劑量組用藥量分別為卡托普利中劑量組的2倍和1/2。計算得出用藥量：卡托普利高劑量組為0.7 mg/100 g，相當(dāng)于臨床劑量的10倍，卡托普利中劑量組0.35 mg/100 g，相當(dāng)于臨床劑量的5倍，卡托普利低劑量組為0.175 mg/100 g，相當(dāng)于臨床劑量的2.5倍，羅格列酮組為0.047 mg/100 g，相當(dāng)于臨床劑量的5倍。

1.2.2樣本采集 給藥結(jié)束，大鼠禁食12 h后稱重，給予1%戊巴比妥鈉0.4 ml/100 g腹腔注射，腹主動脈取血，低溫離心，收集血清保存。然后將肝臟分離并取相同部位稱肝濕重，按組織重量(g) ∶乙醇體積(ml)=1 ∶9在冰水浴條件下進行勻漿并離心收集上清液，在-20 ℃保存；另取相同部位肝組織固定后用于病理學(xué)檢查。

1.2.3指標(biāo)檢測方法 取大鼠血清，通過全自動生化分析儀測定其谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、TC、TG。用TBA法檢測血清MDA；用比色法檢測血清GSH；用酶偶聯(lián)比色法檢測肝臟TG、TC，并計算肝指數(shù)(肝濕重/體重)。CYP2E1是細胞色素P450的一種代謝酶， CYP2E1 mRNA的測定：取少量肝組織磨碎勻漿，提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，分別加入CYP2E1和GAPDH基因引物進行PCR反應(yīng)，然后在1.5%瓊脂糖凝膠中加入PCR產(chǎn)物及標(biāo)志物進行電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)照相、觀察結(jié)果并記錄。肝組織用蘇木精-伊紅染色法染色用于病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1血清生化指標(biāo)與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TC、TG含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利高劑量組血清AST、ALT、TG、TC均降低(P<0.05)，羅格列酮組TG、TC水平降低(P<0.05)，見表1。

2.2大鼠肝濕重、肝指數(shù)和肝組織TG、TC含量與正常組相比，模型組與實驗組肝濕重和肝指數(shù)升高，模型組肝組織TG、TC升高(P<0.05)；與模型組相比，卡托普利高劑量組與羅格列酮組肝濕重與肝指數(shù)降低，卡托普利高劑量組與羅格列酮組肝組織TG及所有實驗組肝組織TC降低(P<0.05)。 見表2。

2.3血清MDA、GSH水平與正常組比較，模型組MDA含量升高、GSH含量降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利高劑量組與羅格列酮組血清MDA含量下降，卡托普利高劑量組血清GSH含量升高(P<0.05)。大鼠肝濕重、肝指數(shù)以及肝組織TG、TC水平。見表3。

表1 大鼠血清AST、ALT、TG、TC水平

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠肝濕重、肝指數(shù)以及肝組織TG、TC水平

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA和GAPDH表達

表3 大鼠血清MDA、GSH水平

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4肝組織CYP2E1mRNA表達與正常組比較，模型組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利高劑量組與羅格列酮組肝組織CYP2E1的表達下降(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達水平

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.5肝組織病理變化正常組肝細胞無炎癥反應(yīng)(圖2A)，模型組可見彌漫性脂肪變性，肝細胞水腫、細胞排列紊亂(圖2B)，卡托普利高劑量組可見少量脂肪變性，大多數(shù)肝細胞排列正常，部分細胞水腫(圖2C)，卡托普利中劑量組肝細胞脂肪變性與炎癥程度略有減輕(圖2D)，卡托普利低劑量組肝脂肪變性與炎癥程度與模型組相似，減輕不明顯(圖2E)，羅格列酮組病理變化情況與卡托普利高劑量組相似(圖2F)。

圖2 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 HE×200

A：正常組；B：模型組；C：卡托普利高劑量組；D：卡托普利低劑量組；E：卡托普利中劑量組；F：羅格列酮組

3 討論

與模型組相比，卡托普利高劑量組大鼠血清AST、ALT含量明顯降低，說明應(yīng)用高劑量卡托普利后大鼠肝細胞損傷減輕，肝臟功能得到改善，血清與肝組織中TC、TG水平降低，說明肝細胞內(nèi)脂質(zhì)減少；實驗組大鼠肝濕重與肝指數(shù)均明顯減小，說明大鼠脂肪含量降低。病理學(xué)觀察顯示卡托普利高劑量組肝細胞變大明顯、細胞水腫的狀態(tài)有所減輕，淋巴細胞也明顯減少，炎癥情況有所好轉(zhuǎn)，脂質(zhì)沉積情況也有所減輕。通過生化檢測與病理觀察，表明卡托普利對大鼠NAFLD有一定的防治作用。MDA的含量可反映機體脂質(zhì)過氧化以及機體細胞過氧化損傷的程度，GSH的含量反映了對機體保持氧化及抗氧化平衡的能力。在本次研究中，通過高脂飼料喂食后，模型組大鼠MDA上升，GSH下降，說明其抗氧化能力減弱，通過給藥卡托普利后，卡托普利高劑量組大鼠MDA下降、GSH上升，表明其抗氧化能力得到增強，機體氧化應(yīng)激程度減輕，從而NAFLD得到改善。

作為細胞色素P450的重要一員，CYP2E1在脂質(zhì)氧化反應(yīng)中表現(xiàn)出很強的促氧化活性。有報道[6]表明，以CYP2E1為中心形成的氧自由基、脂質(zhì)過氧化，進而導(dǎo)致肝實質(zhì)損傷是NAFLD的重要發(fā)病機制。實驗中模型組CYP2E1 mRNA的表達跟正常組比顯著升高，而給藥高劑量卡托普利后，大鼠肝臟CYP2E1 mRNA的表達顯著降低，表明卡托普利可通過減少CYP2E1 mRNA表達，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，改善體內(nèi)氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化狀態(tài)，從而改善NAFLD。

綜上所述，卡托普利對非酒精性脂肪肝能發(fā)揮一定防治作用，同時能增強模型組大鼠抗氧化應(yīng)激從而改善病情。

[1] 李楓林,張 寶,管石俠.非酒精性脂肪肝病大鼠IL-1β, IL-18, TNF-α水平的變化[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016,51(3):351-4.

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[3] Tariq Z,Green C J,Hodson L.Are oxidative stress mechanisms the common denominator in the progression from hepatic steatosistowards non-alcoholic steatohepatitis (NASH)[J].Liver Int,2014,34(7):e180-90.

[4] 張 偉,洪汝濤.NF-κB、氧化應(yīng)激在酒精性脂肪肝發(fā)病機制中的作用及水飛薊素干預(yù)研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué), 2012:1-57.

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