杜少鵬，王佳栩，蔡偉杰，許南松，藍(lán)文琪，陳捷蕓，李彬彬

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是原發(fā)于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，多見于東南亞國(guó)家和我國(guó)南方地區(qū)(廣東、廣西和湖南等)，是高發(fā)于我國(guó)的十大惡性腫瘤之一。以鉑類藥物為主的聯(lián)合用藥作為目前鼻咽癌放化綜合治療常用的一線方案，取得一定效果，但對(duì)機(jī)體有較大的毒副作用[1]。因此，從天然藥物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分，對(duì)于改善鼻咽癌的臨床療效及預(yù)后仍具有重要意義。補(bǔ)骨脂乙素(isobavachalcone，IBC)是一種從中藥補(bǔ)骨脂中提取的天然査爾酮類小分子化合物，具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用。近年來研究[2-4]顯示IBC對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、前列腺癌和胃癌等都有明顯的抑制作用，但對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚不清楚。該研究旨在探討IBC對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制，以期為IBC抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑補(bǔ)骨脂乙素(純度≥98%)購自天津士蘭科技有限公司；用二甲基亞砜溶解后配置成100 mmol/L的母液，-20 ℃保存，臨用時(shí)加培養(yǎng)基稀釋成所需濃度；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自廣州銳博生物公司；AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物公司；兔抗人磷酸化核糖體S6激酶2(phospho-ribosomal S6 kinase 2，p-RSK2)、核糖體S6激酶2(ribosomal S6 kinase 2，RSK2)和c-Jun多克隆抗體購自美國(guó)Cell Signaling公司；鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma 2，Bcl-2)單克隆抗體購自美國(guó)BD公司；鼠抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、β-actin單克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司；DyLight 680/DyLight 800標(biāo)記的紅外二抗購自美國(guó)Abbkine公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) CNE-2Z細(xì)胞為人低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞株，由廣東醫(yī)科大學(xué)中美腫瘤研究所提供，采用含10% 胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè) 將CNE-2Z細(xì)胞以100 μl細(xì)胞懸液含2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后分別加入終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L的IBC(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h；棄去上清液，每孔加入含10 μl CCK-8溶液的培養(yǎng)基100 μl，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。采用IC50軟件計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的IC50值。

1.2.3EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將CNE-2Z細(xì)胞以100 μl細(xì)胞懸液含2 000個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，24 h后分別給予終濃度為0、20、40 μmol/L的IBC(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，作用48 h；隨后加入終濃度為50 μmol/L 的EdU作用2 h；棄上清液，加入4% 多聚甲醛室溫固定 30 min，在0.5% Triton X-100中透膜20 min；隨后依次加入1×Apollo染色反應(yīng)液和1×Hoechst 33342反應(yīng)液，分別室溫避光孵育30 min；熒光顯微鏡下觀察、采集圖像，所有細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光(Hoechst染色)，處于增殖期的細(xì)胞核則顯示紅色熒光(EdU標(biāo)記)。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算EdU標(biāo)記陽性率，EdU標(biāo)記陽性率(%)=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將CNE-2Z 細(xì)胞以每孔400 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度為0、5、10 μmol/L的IBC(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，連續(xù)培養(yǎng)約2周；采用甲醇固定細(xì)胞，0.4%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè) 將CNE-2Z 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中， 24 h后分別給予終濃度為0、20、40 μmol/L IBC，作用48 h；離心收集細(xì)胞，加入500 μl binding buffer重懸細(xì)胞；隨后依次加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液混勻，室溫避光孵育15 min；在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE-2細(xì)胞，給予終濃度為0、20、40 μmol/L的IBC作用48 h，加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min, 離心收集上清液(總蛋白)；用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)印至NC膜上；將膜用封閉液(含5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)的一抗(用一抗稀釋液配制)，于4 ℃孵育過夜；次日用TBST清洗后加入相應(yīng)的紅外標(biāo)記的二抗(用TBST稀釋)，室溫孵育2 h；采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，Quantity one軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，以β-actin 作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞活性的影響給予不同濃度的IBC作用CNE-2Z 細(xì)胞24、48 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性的改變。與對(duì)照組相比，IBC可明顯抑制CNE-2Z細(xì)胞活力，且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，抑制率逐漸增加，呈明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系，各實(shí)驗(yàn)組間抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 h：F=28.66，P<0.05；48 h：F=152.10，P<0.05)，其24 h和48 h的IC50值分別為74.08和25.70 μmol/L。見圖1。

圖1 IBC對(duì)CNE-2Z 細(xì)胞活性的影響

2.2IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖能力的影響為了進(jìn)一步證實(shí)IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖活性的抑制作用，采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變。隨著IBC藥物濃度的增加，EdU 陽性細(xì)胞的百分比逐漸減少，呈劑量依賴性，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.25，P<0.05)，提示 IBC 可有效抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，使處于增殖期的細(xì)胞比率減少。見圖2。

2.3IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞克隆形成能力的影響采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞克隆形成能力的改變。IBC可有效抑制CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成能力，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.01，P<0.05)；與對(duì)照組細(xì)胞相比，10 μmol/L IBC可顯著抑制細(xì)胞的克隆形成能力，其形成克隆變小且數(shù)目明顯減少(P<0.001)。見圖3。

2.4IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用AnnexinV-FITC/ PI雙染法檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的改變。對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率(包括早期和晚期凋亡率)為(4.70 ± 0.69)%，給予20和40 μmol/L IBC處理后，細(xì)胞的凋亡率明顯增高，分別為(17.97 ± 3.10)%和(29.03 ± 1.65)%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.30，P<0.05)；隨著IBC濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡率亦逐漸增高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(F=37.49，P<0.05)。見圖4。

圖2 IBC對(duì) CNE-2Z 細(xì)胞增殖的抑制作用 ×200

A：對(duì)照組；B：20 μmol/L IBC處理組；C：40 μmol/L IBC處理組；
1：Hoechst染色(藍(lán)色)；2：EdU染色(紅色)；3：Hoechst染色和EdU染色的融合；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.001

2.5IBC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響采用Western blot檢測(cè)CNE-2Z 細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。與對(duì)照組相比，給予20、40 μmol/L IBC處理后細(xì)胞中p-RSK2和c-Jun的表達(dá)水平均明顯下降，而總RSK2的表達(dá)沒有改變；IBC亦可引起B(yǎng)cl-2表達(dá)的降低，而Bax的表達(dá)則升高，與對(duì)照組相比，20、40 μmol/L IBC處理后Bcl-2/Bax的比值分別下調(diào)47.24%和69.50%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖3 IBC對(duì) CNE-2Z 細(xì)胞克隆形成的影響

A：對(duì)照組；B：5 μmol/L IBC處理組；C：10 μmol/L IBC處理組；與對(duì)照組比較：**P<0.001

3 討論

中藥補(bǔ)骨脂為豆科草本植物補(bǔ)骨脂的成熟干燥種子，具有溫腎、助陽等功效，在中藥方劑中作為君藥有擴(kuò)冠強(qiáng)心、止血、增強(qiáng)免疫功能、抗菌和抗腫瘤等作用。IBC是從補(bǔ)骨脂中提取的一種活性成分，屬于天然查爾酮類小分子化合物。近年來研究[2-4]顯示，IBC對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。IBC可通過線粒體途徑誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤凋亡，但對(duì)正常小腦顆粒細(xì)胞沒有明顯影響[2]。Jing et al[3]顯示IBC可抑制卵巢癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常肝細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無明顯毒性作用，其機(jī)制與下調(diào)蛋白激酶B磷酸化和活性水平，進(jìn)而促發(fā)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶依賴的凋亡通路有關(guān)。IBC亦可抑制化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌的發(fā)生[5]。這些結(jié)果提示，IBC作為一種來源經(jīng)濟(jì)的天然小分子藥物，具有活性高、毒副作用小等特點(diǎn)，其臨床應(yīng)用價(jià)值值得關(guān)注。

圖4 IBC對(duì) CNE-2Z 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

A：對(duì)照組；B：20 μmol/L IBC處理組；C：40 μmol/L IBC處理組；Q1： 壞死細(xì)胞區(qū)；Q2：晚期凋亡細(xì)胞區(qū)；Q3：活細(xì)胞區(qū)；Q4：早期凋亡細(xì)胞區(qū)；與對(duì)照組比較：**P<0.01

圖5 IBC對(duì) CNE-2Z 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

A：Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平；B：各組Bcl-2/Bax的比值；1：對(duì)照組；2：20 μmol/L IBC處理組；3：40 μmol/L IBC處理組；與對(duì)照組相比：*P<0.05，**P<0.005

本研究應(yīng)用不同濃度的IBC處理低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z后顯示，IBC可明顯抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖和克隆形成，具有時(shí)間、濃度依賴性。進(jìn)一步采用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示與未處理組細(xì)胞相比，IBC可顯著誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡，細(xì)胞早期凋亡率明顯增高，提示IBC抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

RSK2是p90RSK家族的成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶。RSK2是ERK1/2下游的直接底物，在生長(zhǎng)因子等刺激作用下，發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化而被激活。近年來，在多種腫瘤組織中如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌和前列腺癌等都顯示有RSK2表達(dá)或活性的增高，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[6]。抑制RSK2活性或下調(diào)其表達(dá)均可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和侵襲，亦可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[6-7]。這些結(jié)果提示，RSK2可能是一個(gè)潛在的抗癌靶標(biāo)。

RSK2在腫瘤發(fā)生中的作用歸因于其廣泛的底物分子，活化的RSK2可轉(zhuǎn)入核中磷酸化多種底物蛋白，包括cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、糖原合成激酶3、促凋亡蛋白Bad和熱休克蛋白27等，進(jìn)而調(diào)控增殖、分化和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。RSK2也要介導(dǎo)組蛋白H3表觀修飾的改變，在表皮生長(zhǎng)因子和佛波酯等腫瘤促進(jìn)因子的作用下，RSK2可促進(jìn)組蛋白H3Ser10磷酸化，進(jìn)而調(diào)控即刻早期基因c-Jun和c-Fos等的轉(zhuǎn)錄激活。c-Jun是核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1家族的重要成員，其異?；罨c多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。c-Jun可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，阻斷c-Jun活性可抑制cyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[8]。c-Jun亦具有抗凋亡作用，過表達(dá)c-Jun可有效抑制長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。Eferl et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun抗凋亡作用可能與其抑制p53活性進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bcl-XL有關(guān)。本研究顯示，IBC可呈劑量依賴性地抑制p-RSK2和c-Jun的表達(dá)水平，但對(duì)總RSK2的表達(dá)沒有影響，提示IBC可能通過抑制RSK2活性及c-Jun表達(dá)來發(fā)揮抗鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。

Bcl-2和Bax是線粒體凋亡通路中重要的抗凋亡基因和促凋亡基因，兩者的比值決定了對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用的強(qiáng)弱。Chen et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在低分化鼻咽癌組織中的表達(dá)要明顯高于正常鼻咽黏膜組織和鼻咽慢性炎癥組織，并且與鼻咽癌放射敏感性及預(yù)后密切相關(guān)。采用小干擾RNA或小分子抑制劑下調(diào)Bcl-2的表達(dá)可以增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性[12]。本研究檢測(cè)不同濃度IBC對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，隨著IBC作用濃度的增加，Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，而Bax的表達(dá)增高，Bcl-2/Bax蛋白之間的比值明顯下降，提示IBC可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IBC導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)的下調(diào)有望改善鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性和耐藥性，但仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。RSK2亦要參與Bcl-2/Bax表達(dá)的調(diào)控。RSK2可磷酸化促凋亡蛋白Bad，使之不能與Bcl-XL結(jié)合，從而恢復(fù)Bcl-2的抗凋亡能力[13]；RSK2還可通過誘導(dǎo)死亡相關(guān)蛋白激酶的磷酸化進(jìn)而調(diào)控Bcl-2/Bax的比值[14]。

綜上所述，IBC作為一種從天然藥物中提取的低毒小分子化合物，可明顯抑制鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RSK2可能是IBC作用的重要靶分子，其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的調(diào)控可能是IBC抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

[1] Strazzulla A, Barreca G S, Giancotti A, et al. Nasopharyngeal carcinoma: review of the literature with a focus on therapeutical implications [J]. Infez Med, 2015, 23(3): 224-9.

[2] Nishimura R, Tabata K, Arakawa M, et al. Isobavachalcone, a chalcone constituent of angelica keiskei, induces apoptosis in neuroblastoma [J]. Biol Pharm Bull, 2007, 30(10): 1878-83.

[3] Jing H, Zhou X, Dong X, et al. Abrogation of Akt signaling by Isobavachalcone contributes to its anti-proliferative effects towards human cancer cells [J]. Cancer Lett, 2010, 294(2): 167-77.

[4] Jin X, Shi Y I. Isobavachalcone induces the apoptosis of gastric cancer cells via inhibition of the Akt and Erk pathways [J]. Exp Ther Med, 2016, 11(2): 403-8.

[5] Akihisa T, Tokuda H, Hasegawa D, et al. Chalcones and other compounds from the exudates of angelica keiskei and their cancer chemopreventive effects [J]. J Nat Prod, 2006, 69(1): 38-42.

[6] Kang S, Chen J. Targeting RSK2 in human malignancies [J]. Expert Opin Ther Targets, 2011, 15(1): 11-20．

[7] Sulzmaier F J, Young-Robbins S, Jiang P, et al. RSK2 activity mediates glioblastoma invasiveness and is a potential target for new therapeutics [J]. Oncotarget, 2016, 7(48): 79869-84.

[8] Liu Y, Lu C, Shen Q, et al. AP-1 blockade in breast cancer cells causes cell cycle arrest by suppressing G1 cyclin expression and reducing cyclin-dependent kinase activity [J]. Oncogene, 2004, 23(50): 8238-46.

[9] Duan L, Sterba K, Kolomeichuk S, et al. Inducible overexpression of c-Jun in MCF7 cells causes resistance to vinblastine via inhibition of drug-induced apoptosis and senescence at a step subsequent to mitotic arrest [J]. Biochem Pharmacol, 2007, 73(4): 481-90.

[10] Eferl R, Ricci R, Kenner L, et al. Liver tumor development. c-Jun antagonizes the proapoptotic activity of p53 [J]. Cell, 2003, 112(2): 181-92.

[11] Chen M K, Yang S F, Lai J C, et al. Expression of bcl-2 correlates with poor prognosis and modulates migration of nasopharyngeal carcinoma cells [J]. Clin Chim Acta, 2010, 411(5-6): 400-5.

[12] He J H, Liao X L, Wang W, et al. Apogossypolone, a small-molecule inhibitor of Bcl-2, induces radiosensitization of nasopharyngeal carcinoma cells by stimulating autophagy [J]. Int J Oncol, 2014, 45(3): 1099-108.

[13] She Q B, Ma W Y, Zhong S, et al. Activation of JNK1, RSK2, and MSK1 is involved in serine 112 phosphorylation of Bad by ultraviolet B radiation [J]. J Biol Chem, 2002, 277(27): 24039-48.

[14] Tian X, Shi Y, Liu N, et al. Upregulation of DAPK contributes to homocysteine-induced endothelial apoptosis via the modulation of Bcl2/Bax and activation of caspase 3 [J]. Mol Med Rep, 2016, 14(5): 4173-9.