鄭永杰 伍艷芳 李江 章挺 汪信東

（江西省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家林業(yè)局樟樹(shù)工程技術(shù)研究中心，南昌 330032）

抗病基因（R基因）在植物抵御病原菌的入侵過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。在植物與病原菌的相互作用中，植物會(huì)分泌由R基因編碼的R蛋白，直接或間接識(shí)別病原菌分泌的效應(yīng)因子（Avr），激活信號(hào)傳導(dǎo)并引發(fā)一系列防御反應(yīng)，從而抑制病原菌對(duì)植物的侵染過(guò)程。NBS-LRR類(lèi)基因是目前植物中成員數(shù)量最多的一類(lèi)R基因家族，NBS-LRR類(lèi)基因主要由核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（Nucleotide-binding site，NBS）和富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)（Leucine-rich repeat，LRR）編碼組成。NBS結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)ATP和GTP的水解及信號(hào)的傳導(dǎo)［1］，而LRR結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)病原菌蛋白的識(shí)別和相互作用［2］。根據(jù)N末端序列特征，NBS類(lèi)抗病基因主要分為T(mén)NL（TIR-NBS-LRR）抗病基因和CNL（CC-NBS-LRR）抗病基因。有研究發(fā)現(xiàn)部分CNL類(lèi)抗病基因在CC結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在編碼RPW8基因的區(qū)域，命名為RNL類(lèi)抗病基因。擬南芥RPW8類(lèi)基因?qū)Π追鄄【哂袕V譜抗性［3］，異源表達(dá)能夠增強(qiáng)煙草對(duì)白粉病菌［4］和水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。病原微生物侵染植物時(shí)，RPW8類(lèi)基因通過(guò)激活水楊酸（Salicylic acid，SA）信號(hào)通路，誘發(fā)抗病反應(yīng)［5-6］。

目前，不同植物中克隆超過(guò)140個(gè)抗病基因，其中80%屬于NBS-LRR類(lèi)基因。NBS-LRR抗病基因家族已成為植物抗病研究的熱點(diǎn)，已在擬南芥［7］、水稻［8］、楊樹(shù)［9］、葡萄［10］和木薯［11］等植物中展開(kāi)。樟樹(shù)（Cinnamomum camphoraL. Presl.）是自然界中較少受病原體侵害的優(yōu)良抗性種質(zhì)資源，但在生長(zhǎng)過(guò)程中亦受部分病菌侵襲、尤其對(duì)苗期生長(zhǎng)威脅較大。文獻(xiàn)報(bào)道，由殼梭孢菌（Fusicoccumsp.）引起的殼梭孢潰瘍病、擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsissp.）引起的擬莖點(diǎn)潰瘍病和球二孢（Lasiodiplodiasp.）引起的球二孢潰瘍病，嚴(yán)重時(shí)樟樹(shù)發(fā)病率和死亡率將分別高達(dá)90%和80%以上［12-16］；子囊菌亞門(mén)茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria ribis）與半知菌亞門(mén)桑莖點(diǎn)菌（Phoma moricola）引起的爛皮病和由膠孢炭疽?。–olletotrichum gloeosporioidesPenz.）引起的炭疽病嚴(yán)重時(shí)也可致樟樹(shù)整株死亡［17-18］；變色擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis versicolor（Speg.）Stey.）引起的擬盤(pán)多毛孢枝枯病及根腐病對(duì)樟樹(shù)生長(zhǎng)危害也較大［16］。樟樹(shù)白粉病主要發(fā)生在苗期，在不通風(fēng)的苗圃中可致大面積爆發(fā)，引起幼株死亡，成年樟樹(shù)對(duì)白粉病具有較好的抗性。目前樟樹(shù)白粉病菌還未分離鑒定。研究樟樹(shù)抗病基因家族不但有助于自身病害防治而且可為其它易受病害侵襲的植物提供優(yōu)良抗源。在前期研究工作中，江香梅等［19］利用Illumina測(cè)序技術(shù)完成了樟樹(shù)5個(gè)化學(xué)類(lèi)型的葉組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)樟樹(shù)葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中NBS-LRR家族基因進(jìn)行了鑒定和生物信息學(xué)分析，并對(duì)當(dāng)中2個(gè)RNL類(lèi)基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆和表達(dá)分析，以便進(jìn)一步開(kāi)展樟樹(shù)中NBS-LRR基因的功能研究。

1 材料與方法

1.1 材料

樟樹(shù)幼苗感白粉病葉片和正常葉片均于2016年5月取自江西省林業(yè)科學(xué)院苗圃中，取樣材料經(jīng)液氮中迅速冷凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因序列鑒定 基于前期研究獲取的樟樹(shù)葉轉(zhuǎn)錄組注釋數(shù)據(jù)，篩選出注釋結(jié)果為NBS-LRR的Contig序 列， 利 用GENSCAN（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html）預(yù)測(cè)基因，并且翻譯為蛋白序列；進(jìn)一步將得到的蛋白序列分別通過(guò)Pfam（http://pf am.xfam.org/）和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）驗(yàn)證；去除非全長(zhǎng)序列，得到候選的具有全長(zhǎng)ORF的NBS-LRR序列。

1.2.2 基因序列的生物信息學(xué)分析 利用Muscle軟件對(duì)樟樹(shù)NNS-LRR序列進(jìn)行多重比對(duì)分析；利用MEGA7.0.14軟件輸出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果；利用在線(xiàn)分析工具ProParam（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)樟樹(shù)NBS-LRR的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用MEME尋找樟樹(shù)NBS-LRR蛋白序列結(jié)構(gòu)域的潛在保守元件。

1.2.3 樟樹(shù)CcRNL1和CcRNL2基因序列擴(kuò)增 樟樹(shù)總RNA的提取使用RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue（TaKaRa公司）試劑盒，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)，然后用DNase I消化去除基因組DNA。取RNA 樣品 2 μg，以 Oligo（dT）Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa）。利用 Primer 6.0 對(duì)目的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），采用LA Taq保真酶PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 50 ng，10×LA PCR Buffer II（Mg2+free）5 μL，MgCl2（25 mol/L）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mol/L）8 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，加超純水至終體積50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃ 預(yù)變性 3 min；94℃ 變性45 s，56℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 2.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收目標(biāo)大小擴(kuò)增條帶（天根DNA回收試劑盒），回收產(chǎn)物鏈接到pMD18-T 載體上（TaKaRa），轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，委托上海生工進(jìn)行目標(biāo)基因測(cè)序。

1.2.4 樟樹(shù)CcRNL1和CcRNL2基因的表達(dá)模式分析 以樟樹(shù)正常葉和感白粉病葉組織的cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)定量（qRT-PCR）和半定量RT-PCR（SqRT-PCR）檢測(cè)CcRNL1和CcRNL2基因相對(duì)表達(dá)量。用Oligo6軟件進(jìn)行RT-PCR引物設(shè)計(jì)，樟樹(shù)Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因（表1）。qRT-PCR 反應(yīng)體系 ：2×SYBR premix Ex TaqTM 12.5 μL，50×ROX Reference DYE 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 25 ng，加超純水至終體積 25 μL。擴(kuò)增程序 ：95℃ 2 min ；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線(xiàn)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-RAD，CF×96TMReal-Time System）上進(jìn)行操作，每個(gè)樣品重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)參照2-△△CT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量［20］。SqRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 20 ng，10×PCR Buffer II（Mg2+free）2 μL，MgCl2（25 mol/L）1.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mol/L）1.3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，加超純水至終體積 20 μL。擴(kuò)增程序 ：94℃ 預(yù)變性 3 min ；94℃ 變性45 s，56℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 樟樹(shù)NBS-LRR基因的鑒定

基于樟樹(shù)葉組織轉(zhuǎn)錄組序列的注釋結(jié)果，篩選注釋為NBS-LRR的序列，利用Pfam和SMART在線(xiàn)網(wǎng)站驗(yàn)證后獲得具有NBS保守結(jié)構(gòu)域的NBS-LRR蛋白序列。進(jìn)一步去除非全長(zhǎng)的NBS-LRR序列之后，在樟樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共篩選到28個(gè)具有全長(zhǎng)序列的NBS-LRR基因（表2）。樟樹(shù)NBS-LRR家族成員的ORF長(zhǎng)度為2 118-3 378，編碼氨基酸個(gè)數(shù)為705-1 125，分子量在80.85-128.10 kD，理論等電點(diǎn)為5.35-9.03，不穩(wěn)定系數(shù)為44.05-55.84、為不穩(wěn)定蛋白；平均疏水性為負(fù)值，為親水性蛋白。樟樹(shù)NBSLRR蛋白不存在信號(hào)肽序列，為非分泌蛋白。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，樟樹(shù)NBS-LRR蛋白都具有特征結(jié)構(gòu)域NBS結(jié)構(gòu)域，C末端都具有LRR結(jié)構(gòu)域，其中26條序列N末端存在螺旋卷曲（Coiled-coiled，CC）結(jié)構(gòu)，屬于CNL類(lèi)基因；2條序列N末端存在RPW8結(jié)構(gòu)域，屬于RNL類(lèi)基因；未發(fā)現(xiàn)TNL類(lèi)基因。

2.2 樟樹(shù)NBS-LRR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及保守結(jié)構(gòu)域分析

進(jìn)一步對(duì)樟樹(shù)NBS-LRR基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，利用Mega 7.0.14軟件以鄰接法構(gòu)建了樟樹(shù)NBS-LRR蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并且利用在線(xiàn)分析工具M(jìn)EME鑒定樟樹(shù)NBS結(jié)構(gòu)域的Motif特征。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果（圖1）顯示，28個(gè)NBS-LRR蛋白被分為5個(gè)亞組。樟樹(shù)的NBS保守結(jié)構(gòu)域包含8個(gè)Motif（表3），其中6個(gè)Motif為已知元件，分別為P-loop、GLPL、RNBS-A、RNBS-B、RNBS-C和Kinase-2元件，2個(gè)為未知元件。

2.3 樟樹(shù)CcRNL基因的克隆與序列分析

基于對(duì)樟樹(shù)NBS類(lèi)抗病基因家族的生物信息學(xué)分析，本研究挑取N末端存在RPW8結(jié)構(gòu)域的RNL類(lèi)基因（CL4083.Contig1_All 和 CL4083.Contig2_All）進(jìn)行克隆。PCR擴(kuò)增如圖2顯示，擴(kuò)增的目的基因ORF條帶大小約2 400 bp，分別將其命名為CcRNL1和CcRNL2。經(jīng)過(guò)測(cè)序，CcRNL1序列長(zhǎng)度為2 460 bp，CcRNL2序列長(zhǎng)度為2 466 bp。序列比對(duì)結(jié)果顯示，CcRNL1和CcRNL2序列在氨基酸水平上相似性為71%，除含有NBS基因家族保守結(jié)構(gòu)域中的P-loop，Kinase-2，GLPL motif和C末端的LRR motif外，在N末端具有RPW8 motif，均屬于NBS基因家族的RNL類(lèi)基因（圖3）。

表2 樟樹(shù)NBS-LRR基因家族生物信息學(xué)分析

2.4 樟樹(shù)CcRNL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究樟樹(shù)CcRNL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載典型的植物RNL蛋白及近源蛋白氨基酸序列，與本研究獲得的CcRNL基因的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，RNL蛋白主要分為ADR1亞家族和NRG1亞家族兩類(lèi)，其中樟樹(shù)CcRNL蛋白與擬南芥ADR1蛋白聚為一類(lèi)，屬于ADR1類(lèi)亞家族，且與油棕（Elaeis guineensis）的親緣關(guān)系最近。

2.5 CcRNL基因的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步探究CcRNL1和CcRNL2的功能，利用實(shí)時(shí)定量PCR和半定量PCR對(duì)兩者在樟樹(shù)感白粉病葉片和正常葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）顯示：2個(gè)基因在樟樹(shù)正常葉和感白粉病葉中均有表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)水平有所差異，其中CcRNL1在樟樹(shù)感白粉病葉中的表達(dá)明顯高于正常葉，而CcRNL2在感白粉病和正常葉中的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。由此可見(jiàn)CcRNL1可被樟樹(shù)白粉病菌誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其可能與響應(yīng)樟樹(shù)白粉病脅迫反應(yīng)有關(guān)，但還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 樟樹(shù)NBS-LRR抗病基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

表3 樟樹(shù)NBS結(jié)構(gòu)域保守元件分析

3 討論

圖2 樟樹(shù)CcRNL1和CcRNL2基因的擴(kuò)增圖

NBS-LRR基因家族是植物中發(fā)現(xiàn)的成員最多的抗病基因家族，也是目前植物抗病性研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。樟樹(shù)是自然界中較少受病原體侵害的優(yōu)良抗性種質(zhì)資源，挖掘樟樹(shù)R基因尤其具有廣譜抗性的R基因?qū)ζ渌赘胁≈参镄驴剐苑N質(zhì)創(chuàng)制具有重要意義。但目前樟樹(shù)基因組沒(méi)有公布，給樟樹(shù)優(yōu)良抗性基因的挖掘和功能研究帶來(lái)了困難。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)樟樹(shù)5種化學(xué)類(lèi)型的葉轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，構(gòu)建了含55 955條樟樹(shù)unigene序列的數(shù)據(jù)庫(kù)?；诖藬?shù)據(jù)庫(kù)，借助生物信息學(xué)的手段對(duì)樟樹(shù)NBS-LRR抗病基因進(jìn)行了研究。利用葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一共獲得了28個(gè)具有完整ORF的NBS-LRR序列，根據(jù)氨基酸保守結(jié)構(gòu)域的不同劃分為2類(lèi)，包括26條CNL基因和2條RNL基因，基因數(shù)量偏少，可能與組織差異表達(dá)有關(guān)。另外，葉轉(zhuǎn)錄組中未發(fā)現(xiàn)TNL類(lèi)抗病基因，這和水稻［8］、高粱［25］的情況類(lèi)似，體現(xiàn)了樟樹(shù)作為基底被子植物系統(tǒng)發(fā)育特征，即進(jìn)化地位介乎于單子葉植物和真核雙子葉植物之間。

圖3 CcRNL1和CcRNL2蛋白序列比對(duì)

目前，已從不同植物中克隆得到NBS-LRR類(lèi)基因。例如，馮艷芳等［26］克隆了花生AhDNrp基因，該基因?qū)儆贑NL類(lèi)抗病基因，在花生根部特異表達(dá)，且參與花生黃曲霉抗病反應(yīng)過(guò)程。Peart等［27］克隆了NRG1基因，并且利用病毒誘導(dǎo)沉默技術(shù)（VIGS）驗(yàn)證了NRG1基因?qū)煵莼ㄈ~病毒（TMV）表現(xiàn)出抗性。本研究克隆了兩個(gè)樟樹(shù)RNL類(lèi)的基因，分別命名為CcRNL1和CcRNL2，序列長(zhǎng)度為2 460 bp和2 466 bp，兩者在氨基酸水平上相似性71%。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)基因除含有典型的NBS結(jié)構(gòu)域和LRR結(jié)構(gòu)域之外，在N端還存在RPW8結(jié)構(gòu)域。RNL類(lèi)基因劃分為ADR1類(lèi)亞家族和NRG1類(lèi)亞家族兩類(lèi)，聚類(lèi)分析結(jié)果顯示CcRNL屬于ADR1類(lèi)亞家族。研究表明，擬南芥ADR1通過(guò)激活SA信號(hào)通路，參與白粉病和霜霉病的宿主防御反應(yīng)［28］。在本研究中，樟樹(shù)幼苗受白粉病菌侵襲后，CcRNL1基因的表達(dá)量相比正常生長(zhǎng)個(gè)體顯著上升，說(shuō)明該基因可能參與了響應(yīng)白粉病菌脅迫反應(yīng)過(guò)程，是否通過(guò)SA信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。

圖4 NBS-LRR抗病基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

4 結(jié)論

圖5 實(shí)時(shí)定量和半定量檢測(cè)CcRNL1和CcRNL2白粉病誘導(dǎo)表達(dá)

本研究以樟樹(shù)葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)NBS-LRR基因家族進(jìn)行了鑒定和分析。在樟樹(shù)葉組織轉(zhuǎn)錄組中鑒定獲得了28個(gè)NBS-LRR基因，包括26個(gè)CNL類(lèi)基因和2個(gè)RNL類(lèi)基因。在樟樹(shù)葉組織中克隆了2個(gè)RNL類(lèi)R基因，分別命名為CcRNL1和CcRNL2，聚類(lèi)分析結(jié)果顯示二者都屬于ADR1類(lèi)亞家族成員。半定量分析顯示CcRNL1受樟樹(shù)白粉病菌誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其可能參與了響應(yīng)白粉病菌脅迫反應(yīng)過(guò)程。

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