徐 華 張 茹 劉連亮 張進(jìn)杰 楊文鴿 樓喬明

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)，又名裂壺藻，其屬于真菌門(mén)(Eumycota)、網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes)、破囊壺菌目(Thraustochytriales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的一類類藻的海洋微生物[1]。裂殖壺菌的菌體脂質(zhì)含量豐富，且以甘油三酯為主，DHA占總脂肪酸含量的30%～40%，被認(rèn)為是一種理想的DHA新生資源。目前，從裂殖壺菌中提取制備高純度DHA已日益成為國(guó)內(nèi)外海洋生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)[2-3]。

水酶法是近年來(lái)廣泛研究的一種油脂提取新技術(shù)，是將生物酶制劑應(yīng)用于油脂分離的方法，通過(guò)酶制劑對(duì)油料底物的降解作用，提高油脂出油率；該方法具有選擇性降解、副產(chǎn)物少、出油率高、油質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用水酶法對(duì)裂殖壺菌油脂的提取工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化，以期為裂殖壺菌油脂提取及后續(xù)工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)干粉：廈門(mén)匯盛生物有限公司，經(jīng)Folch法測(cè)定，其油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.63%。菠蘿蛋白酶(50萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g)、酸性蛋白酶(80萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、中性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、纖維素酶(5萬(wàn)U/g)：均為食品級(jí)試劑酶，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；甲醇、氯仿、正己烷：均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器和設(shè)備

6890N型氣相色譜儀、5973型質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：德國(guó)海道爾夫公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水酶法提取的工藝流程

裂殖壺菌干粉→加水→微波預(yù)處理→酶解→正己烷萃取→減壓濃縮→油脂

提取工藝要點(diǎn)：取2 g裂殖壺菌干粉，按一定液料比加入蒸餾水，并微波5 min(微波頻率2 450 MHz，輸出功率450 W)；待樣品冷卻至室溫，加入一定量的酶制劑，放于水浴恒溫振蕩器中60 r/min進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后，按裂殖壺菌干粉質(zhì)量，以2 mL/g的用量加入正己烷，振蕩萃取2 min，于5 000 r/min離心5 min，收集上層正己烷相，重復(fù)萃取2次，合并正己烷相；經(jīng)40 ℃減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重，稱取油脂質(zhì)量，并計(jì)算裂殖壺菌油脂提取率。油脂提取率的計(jì)算公式為：

1.3.2 酶的選取和復(fù)合酶配比的確定

取2 g裂殖壺菌干粉，按2 mL/g的液料比加入蒸餾水，微波處理后，按1 000 U/g的添加量分別加入纖維素酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶，并以不加酶制劑為對(duì)照，于50 ℃恒溫水浴酶解3 h，酶解結(jié)束后用正己烷萃取油脂，計(jì)算裂殖壺菌的油脂提取率；并以纖維素酶和中性蛋白酶組成復(fù)合酶，測(cè)定兩者間的配比對(duì)裂殖壺菌油脂提取率的影響。

1.3.3 單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在復(fù)合酶配比為2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)的基礎(chǔ)上，以液料比、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間為因素，以油脂提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)；并綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用極差法對(duì)上述4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，正交因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.4 脂肪酸分析

甲酯化衍生取10 mg所提的裂殖壺菌油脂，加入1 mL的2 mol/L HCl-甲醇溶液，于60 ℃水浴中甲酯化15 min，冷卻后加入1 mL正己烷振蕩，靜置分層后，取上清液用無(wú)水硫酸鈉干燥，供GC-MS分析。

色譜條件HP-INNOWax石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力為54 kPa，分流比為25:1。進(jìn)樣口溫度為230 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃，柱溫以3 ℃/min由120 ℃升到210 ℃，并在210 ℃下保持10 min，整個(gè)分析過(guò)程為40 min。

質(zhì)譜條件GC-MS接口溫度280 ℃，EI離子源,電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描周期2.84次/s，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500 u。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每次實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析法(ANOVE，Tukey檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并通過(guò)Duncan’s法進(jìn)行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的選擇與配比優(yōu)化

在液料比2 mL/g條件下，按1 000 U/g的加酶量分別添加纖維素酶(Cel)、菠蘿蛋白酶(Bro)、木瓜蛋白酶(Pap)、酸性蛋白酶(Aci)、堿性蛋白酶(Alc)和中性蛋白酶(Neu)，并以不加酶制劑為對(duì)照(Con)，置于50 ℃恒溫水浴振蕩酶解3 h，不同酶制劑對(duì)油脂提取的影響如圖1所示。

圖1 酶制劑對(duì)油脂提取率的影響

由圖1可知，添加纖維素酶或蛋白酶能顯著增加裂殖壺菌的油脂提取率(P<0.05)，且不同酶制劑對(duì)油脂提取率具有顯著差異(P<0.05)，其中中性蛋白酶的油脂提取率最高(44.96%)，菠蘿蛋白酶(40.04%)、堿性蛋白酶(37.13%)、木瓜蛋白酶(36.84%)和酸性蛋白酶(35.61%)的提取率依次降低，而纖維素酶的油脂提取率最低，僅為20.61%。這是因?yàn)槔w維素酶和不同蛋白酶的酶解底物、作用位點(diǎn)和催化活力不同[6]。裂殖壺菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，以及細(xì)胞中存在的脂蛋白復(fù)合體，對(duì)油脂分子具有包埋作用，不利于油脂的提取。單獨(dú)水提熱處理很難破壞細(xì)胞壁和脂蛋白復(fù)合體對(duì)油脂分子的包埋作用，而纖維素酶和蛋白酶能分別有效降解裂殖壺菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和脂蛋白復(fù)合體，使包埋的油脂釋放出來(lái)，提高油脂提取率[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加纖維素酶和不同蛋白酶能分別有效降解破壞裂殖壺菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和脂蛋白復(fù)合體，釋放油脂，從而顯著提高裂殖壺菌的油脂提取率。

酶制劑具有較強(qiáng)的底物專一性，這意味著采用單一酶制劑在酶解提取油脂的工藝應(yīng)用中具有一定的局限性；根據(jù)酶解底物基本性質(zhì)，選擇合適的幾種酶制劑復(fù)合使用，能兼具多種生物酶的不同活性，并對(duì)酶解過(guò)程產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用，更有利于細(xì)胞中油脂的析出和聚集，進(jìn)而提高油脂提取率[7]。因此根據(jù)單一酶制劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合裂殖壺菌細(xì)胞壁構(gòu)成和胞內(nèi)脂蛋白復(fù)合物的底物性質(zhì)，采用纖維素酶和中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合配比實(shí)驗(yàn)，復(fù)合酶不同配比對(duì)油脂提取率的影響如圖2所示。

圖2 復(fù)合酶配比對(duì)油脂提取率的影響

由圖2可知，在復(fù)合酶的總酶活為1 000 U/g的前提下，纖維素酶和中性蛋白酶的不同配比，對(duì)裂殖壺菌油脂的提取率產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。首先，隨著中性蛋白酶含量的增加，裂殖壺菌的油脂提取率顯著增加(P<0.05)；當(dāng)纖維素酶和中性蛋白酶的酶活力比值為2:8時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大值(50.16%)，遠(yuǎn)高于單獨(dú)使用纖維素酶(20.61%)和中性蛋白酶(44.96%)。之后，隨著中性蛋白酶含量的繼續(xù)增加，油脂提取率略有降低。因此選取復(fù)合酶配比為2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)進(jìn)行后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

在復(fù)合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)的條件下，以液料比、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，測(cè)定上述4種因素的不同水平對(duì)裂殖壺菌油脂提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同因素對(duì)油脂提取率的影響

在復(fù)合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、加酶量1 000 U/g、酶解溫度50 ℃和酶解時(shí)間3 h條件下，當(dāng)液料比為2 mL/g時(shí)，裂殖壺菌油脂提取率為50.16%，同時(shí)隨著液料比的增大，裂殖壺菌油脂提取率顯著增加(P<0.05)；當(dāng)液料比達(dá)到4 mL/g時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大值(62.43%)；繼續(xù)增加液料比，裂殖壺菌油脂提取率顯著降低(P<0.05)。這是由于當(dāng)液料比較低時(shí)，物料較為黏稠，不利于酶與底物的充分接觸，酶解反應(yīng)不能有效進(jìn)行，且較低的液料比不利于油脂分子的游離，致使油脂提取率較低；隨著液料比的適當(dāng)增加，增加酶與底物的有效接觸，并降低溶劑中油脂濃度，增加物料與溶劑間的濃度差，降低酶解體系的乳化效應(yīng)，增加物料中油脂向溶劑擴(kuò)散的速度和游離速度，從而顯著增加油脂提取率[8-9]。當(dāng)液料比大于4 mL/g，繼續(xù)增加液料比，使酶解體系中的酶和底物濃度雙雙降低，影響酶解作用的發(fā)揮；且較高的液料比易增加后續(xù)工藝的難度和強(qiáng)度。因此裂殖壺菌油脂提取的最佳液料比為4 mL/g。

在復(fù)合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、液料比2 mL/g、酶解溫度50 ℃和酶解時(shí)間3 h條件下，隨著加酶量的增加，裂殖壺菌油脂提取率顯著增加(P<0.05)，當(dāng)加酶量為2 500 U/g，油脂提取率達(dá)到最大值(65.39%)；繼續(xù)增加復(fù)合酶用量，油脂提取率不再增加，并有一定的降低趨勢(shì)，但下降幅度不顯著(P>0.05)。這是因?yàn)檫m當(dāng)增加酶用量，能有效提高酶濃度，增加酶與底物的接觸幾率，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而增加油脂提取率。但當(dāng)加酶量超過(guò)一定范圍時(shí)，易使酶解體系發(fā)生深度水解，水解產(chǎn)物增強(qiáng)蛋白質(zhì)的乳化性，使油脂分子再度被蛋白質(zhì)包裹，產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，增加油脂分離難度；同時(shí)加酶量過(guò)多使得酶分子間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，降低酶的作用效率，致使油脂提取率降低[10]。因此裂殖壺菌油脂提取的最佳加酶量為2 500 U/g。

在復(fù)合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、液料比2 mL/g、加酶量1 000 U/g和酶解時(shí)間3 h條件下，在一定酶解溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的上升，裂殖壺菌油脂提取率先增加，并在55 ℃時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大值(50.83%)；繼續(xù)提高酶解溫度，油脂提取率顯著降低(P<0.05)。適當(dāng)提高酶解溫度有利于提高纖維素酶和中性蛋白酶的酶解活性，纖維素酶的最適溫度為50 ℃，中性蛋白酶的最適溫度為55 ℃，故在55 ℃溫度條件下，由纖維素酶和中性蛋白酶組成的復(fù)合酶的酶解活性最強(qiáng)；而繼續(xù)增加酶解溫度則會(huì)破壞纖維素酶和中性蛋白酶的活性中心，進(jìn)而降低裂殖壺菌的油脂提取率，且酶解溫度的增加還易造成油脂氧化，降低油脂品質(zhì)[11]。因此綜合考慮油脂提取率和后續(xù)油脂品質(zhì)，裂殖壺菌油脂提取的最佳酶解溫度為55 ℃。

在復(fù)合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、液料比2 mL/g、加酶量1 000 U/g和酶解溫度50 ℃條件下，當(dāng)酶解時(shí)間為1 h時(shí)，裂殖壺菌油脂提取率僅為32.54%；隨著酶解時(shí)間的增加，油脂提取率顯著增加(P<0.05)；當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大值(54.23%)。之后，隨著酶解時(shí)間的增加，油脂提取率趨于平緩，繼續(xù)增加酶解時(shí)間對(duì)裂殖壺菌油脂提取率沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；同時(shí)，進(jìn)一步延長(zhǎng)酶解時(shí)間，易使酶解體系中乳狀液趨于穩(wěn)定，造成破乳困難，降低油脂提取率[12]；且裂殖壺菌富含DHA，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易使油脂發(fā)生氧化，降低油脂品質(zhì)。因此裂殖壺菌油脂提取的最佳酶解溫度為4 h。

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，以纖維素酶和中性蛋白酶為復(fù)合酶(2:8，U:U)，選取液料比、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以油脂提取率為指標(biāo)，采用正交方法考察各因素對(duì)裂殖壺菌油脂提取率的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果列于表2，其方差分析結(jié)果列于表3。

表2 正交優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00；*表示P<0.05，差異顯著。

由表2可知，水酶法提取裂殖壺菌油脂的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)油脂提取率的影響依次為：加酶量>液料比>酶解時(shí)間>酶解溫度，即加酶量對(duì)裂殖壺菌油脂提取的影響最大，液料比和酶解時(shí)間次之，酶解溫度最??；并對(duì)上述4個(gè)因素進(jìn)行方差分析可知，加酶量和液料比對(duì)裂殖壺菌油脂提取率有顯著影響(P<0.05)，而酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)油脂提取率的影響不顯著(P>0.05)，優(yōu)化后的油脂提取條件為A2B3C3D2，即液料比4 mL/g，加酶量2 500 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間4 h；并在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，裂殖壺菌油脂提取率達(dá)到82.47%。

2.4 裂殖壺菌脂肪酸組成分析

裂殖壺菌油脂經(jīng)酸酯化衍生處理，采用GC-MS技術(shù)對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖見(jiàn)圖4；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等方法對(duì)其脂肪酸進(jìn)行定性，并按峰面積歸一法進(jìn)行定量，分析鑒定結(jié)果列于表4。

從表4可知，從裂殖壺菌油脂中共鑒定出18種脂肪酸，以C14:0(4.00%)、C16:0(54.37%)、C22:5n-6(3.94%)和C22:6n-3(DHA，32.65%)為主；其中飽和脂肪酸6種，占總脂肪酸含量的59.68%；不飽和脂肪酸12種，占總脂肪酸含量的40.32%。C22:6n-3是一種重要的n-3型多不飽和脂肪酸，能有效促進(jìn)嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，提高智力；調(diào)節(jié)血脂，預(yù)防心腦血管疾病；提高免疫力，增強(qiáng)抗炎、抗癌能力[13-15]。裂殖壺菌油脂富含C22:6n-3，表明其具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可作為C22:6n-3的重要生物來(lái)源；同時(shí)其脂肪酸組成簡(jiǎn)單，與C22:6n-3結(jié)構(gòu)類似但功能上有拮抗作用的C20:5n-3(EPA)含量極低，僅為0.52%，這便于C22:6n-3的分離純化和高純度C22:6n-3的制備；同時(shí)這一脂肪酸組成特征也將拓展裂殖壺菌油脂在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，尤其在嬰幼兒食品方面。

注：圖中序號(hào)與表4中序號(hào)一致。圖4 裂殖壺菌脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖 表4 裂殖壺菌油脂的脂肪酸組成(n=3)

序號(hào)保留時(shí)間/min脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%13.91C1200.15±0.0226.66C1404.00±0.1737.02C141n-50.30±0.0348.50C1500.17±0.02510.90C16054.37±0.68611.20C161n-90.18±0.02713.41C1700.12±0.03815.44C1800.86±0.05915.77C181n-90.34±0.041015.94C181n-70.25±0.021116.82C182n-60.79±0.041218.38C183n-60.15±0.021319.09C183n-30.11±0.021422.84C204n-60.84±0.041523.96C204n-30.25±0.021624.48C205n-3(EPA)0.52±0.041730.20C225n-6(DPA)3.94±0.121833.42C226n-3(DHA)32.65±0.46

3 結(jié)論

3.1 以纖維素酶和中性蛋白酶組成水解復(fù)合酶，兩者配比為2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)，并經(jīng)單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到水酶法提取裂殖壺菌油脂的最佳工藝條件：液料比4 mL/g，加酶量2 500 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間4 h；在此優(yōu)化條件下，裂殖壺菌油脂提取率為82.47%。

3.2 裂殖壺菌油脂脂肪酸組成簡(jiǎn)單，以C14:0、C16:0、C22:5n-6和C22:6n-3為主，其中C22:6n-3質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)32.65%，表明裂殖壺菌油脂具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和脂質(zhì)開(kāi)發(fā)潛力，可以作為制備天然高純度C22:6n-3的重要生物來(lái)源。

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