趙雅楠 王 穎,2 張東杰

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)

綠豆(Vignaradiate)是豇豆屬(Vigna)亞洲豇豆亞屬(Ceratotropis)的主要栽培豆種，富含多種維生素和礦物元素，是廣受歡迎的藥食同源作物，在我國(guó)具有悠久的栽種歷史，種質(zhì)資源豐富，種類繁多[1]。近些年，受優(yōu)良品種廣泛應(yīng)用化和種質(zhì)資源應(yīng)用同質(zhì)化趨勢(shì)的影響，綠豆品種遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越狹窄，優(yōu)異基因大量流失，品種間相似度高，傳統(tǒng)方法難以區(qū)分鑒別[2]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)分子標(biāo)記技術(shù)因其多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等顯著特點(diǎn)，已逐漸成為作物遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建的重要途徑[3-5]。Molla等[6]利用5對(duì)SSR引物對(duì)42個(gè)綠豆品種進(jìn)行遺傳多樣性并構(gòu)建其SSR指紋圖譜，共獲得20個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為4個(gè)，PIC值變幅介于0.538～0.803之間，平均為0.637，5對(duì)核心引物可將42個(gè)品種完全區(qū)分開，證明SSR技術(shù)是構(gòu)建綠豆指紋圖譜的有效途徑，可為綠豆品種鑒定區(qū)分提供參考；劉巖等[7]對(duì)全國(guó)不同地理來(lái)源的272份綠豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)綠豆種質(zhì)資源遺傳多樣性水平較高，但也存在一定程度的近交現(xiàn)象；任紅曉等[8]利用39對(duì)SSR引物對(duì)中國(guó)北方地區(qū)78份綠豆名優(yōu)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均等位基因數(shù)為2.74，平均PIC值為0.26，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古是綠豆名優(yōu)資源較豐富地區(qū)，而山西大同綠豆資源的遺傳多樣性水平則相對(duì)較低。

吉林是我國(guó)綠豆播種和產(chǎn)出大省，以2014年為例，吉林省綠豆播種面積和產(chǎn)量均居全國(guó)首位，分別占總量的23.24%和19.27%，然而關(guān)于吉林省綠豆種質(zhì)資源的研究較少，且目前鮮有基于SSR技術(shù)分析該地區(qū)綠豆資源遺傳多樣性及指紋圖譜構(gòu)建的報(bào)道，僅有少數(shù)研究中涉及了部分品種數(shù)量較少，不能客觀反映該地區(qū)種質(zhì)遺傳背景。同時(shí)，傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記都是基于聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，分辨率低、操作復(fù)雜，易產(chǎn)生誤差[9-11]?；诖?，本研究利用SSR熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)吉林省24個(gè)市縣的74份綠豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建其指紋圖譜，以期為理清吉林省綠豆資源遺傳差異、加強(qiáng)資源利用效率奠定基礎(chǔ)，也為我國(guó)綠豆品種真?zhèn)舞b定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及資源保護(hù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選取吉林省長(zhǎng)春市、安圖縣及洮安縣等24個(gè)縣市的74份綠豆品種為實(shí)驗(yàn)材料，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，詳情見(jiàn)表1。

150對(duì)引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，由上海生物工程技術(shù)公司合成。以不同地理來(lái)源的10份綠豆種質(zhì)DNA為模板，初篩150對(duì)引物，選取條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的9對(duì)引物用于全部供試綠豆種質(zhì)資源的研究。9對(duì)核心SSR熒光標(biāo)記引物由美國(guó)ABI公司合成，在正向引物上分別加注熒光染料5’HEX(綠色)、5’FAM(藍(lán)色)和5’TMRA(黃色)。

表1 供試綠豆品種信息

表1(續(xù))

1.2 主要試劑及儀器

植物基因組DNA提取試劑盒、Mg2+、Taq酶、dNTPs、Buffer、瓊脂糖、標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量等均購(gòu)于北京天根生物技術(shù)有限公司。

ABI Prism 3730XL型基因分析儀：上海艾研生物科技有限公司；WD-9402C基因擴(kuò)增儀：北京六一生物科技有限公司；2-16PK高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；Alpha凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)：上海皓莊儀器有限公司；SANYO SIM-F14全自動(dòng)制冰機(jī)：上海迭戈生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

每份材料取3粒播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，室溫條件下種植10 d左右，采集剛展開的新鮮嫩葉，液氮環(huán)境下研磨成粉。利用試劑盒法提取基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后稀釋成20 ng/μL置于4 ℃環(huán)境下備用。

1.3.2 SSR-PCR

PCR體系共20 μL，包括20 ng/μL DNA模板3 μL，2 μmol/L引物0.6 μL，2.5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，20 mmol/L MgCl21 μL，Buffer 2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度35 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃ 3 min；4 ℃保存。在WD-9402C基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.3.3 熒光標(biāo)記毛細(xì)管檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

對(duì)74份綠豆樣品熒光標(biāo)記引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除鹽分、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100:1的體積比混勻，取15 μL于上樣板中，將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1倍，取1 μL加入，在3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行片段測(cè)定，用GeneMapper對(duì)上機(jī)結(jié)果進(jìn)行片段大小及基因型分析。最后利用POPGENE version 1.32計(jì)算各遺傳參數(shù)，用UPGMA[12,13]法繪制各材料間的親緣關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性

9對(duì)SSR引物在74份綠豆品種中共檢測(cè)到40個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)從2(P3-581)～9(X55)個(gè)不等，平均為4.44個(gè)。Nei’s基因多樣性指數(shù)變化范圍介于0.195 5(GBssr-MB9)～1.688 9(X55)之間，平均為2.35。多態(tài)信息含量PIC值變化范圍介于0.076 8～0.725 4之間，平均為0.45。其中標(biāo)記X55(0.725 4)、X46(0.648 3)和X168(0.504 1)為高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.5)，多態(tài)性較豐富；標(biāo)記GBssr-MB91的PIC值小于0.25，為低度多態(tài)位點(diǎn)，檢測(cè)能力較弱；而其余5個(gè)標(biāo)記均為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25

表2 基于9個(gè)SSR分子標(biāo)記的74個(gè)綠豆品種多態(tài)性信息

2.2 遺傳多樣性分析

依據(jù)9對(duì)SSR引物在74份綠豆品種中所獲得的40個(gè)等位基因，按Nei’s的方法利用NTSYSpc 2.0軟件統(tǒng)計(jì)供試間的遺傳相似系數(shù)[14-15]。所有參試品種間遺傳相似系數(shù)變幅介于0.111 1～1.000 0之間，平均為0.499 0。根據(jù)所獲得的2 701個(gè)遺傳相似系數(shù)，以0.05為組距進(jìn)行次數(shù)分布分析(圖1)。74份綠豆品種的遺傳相似系數(shù)不呈正態(tài)分布，在遺傳相似系數(shù)為0.25～0.45之間存在一個(gè)高峰段，分布了1 279個(gè)遺傳相似系數(shù)，占全部數(shù)據(jù)的47.35%；另一高峰段在遺傳相似系數(shù)為0.55～0.70之間，數(shù)量為699個(gè)，占全部數(shù)據(jù)的25.88%。有1 159個(gè)遺傳相似系數(shù)在0.6～1.0之間，占全部數(shù)據(jù)的42.91%，而僅有73個(gè)遺傳相似系數(shù)在0～0.25之間，占全部數(shù)據(jù)的2.70%，說(shuō)明目前吉林省綠豆種質(zhì)資源的遺傳相似性較高，遺傳差異較大的品種數(shù)量較少。

圖1 遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布

2.3 聚類分析

通過(guò)UPGMA法利用遺傳相似系數(shù)對(duì)74份吉林地區(qū)綠豆材料進(jìn)行聚類分析。由圖2可知，供試材料間遺傳差異較小，在遺傳相似系數(shù)為0.503 7的閾值處，可將74份綠豆材料分為三大類群。類群Ⅰ包括綠豆(C0688)、綠小豆(C0712)在內(nèi)的40個(gè)品種；類群Ⅱ包括小鸚哥豆(C0705)、GCM8703-H-3(C4449)等30個(gè)品種；類群Ⅲ由綠豆(C0692)、小綠豆(C0754)、綠小豆(C0712)和大綠豆(C0743)4個(gè)品種組成。類群I品種的遺傳相似性較高，如小綠豆(C0690)、小綠豆(C0716)、小粒綠豆(C0745)等4個(gè)縣市的12個(gè)品種間遺傳相似系數(shù)均達(dá)到了1.0，說(shuō)明要想?yún)^(qū)分開這些品種需要篩選更多的SSR引物，同是也反映出吉林省綠豆種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性水平較低。在遺傳相似系數(shù)為0.572 2處，可將類群Ⅱ分為2個(gè)亞群。類群Ⅲ僅包含4個(gè)品種，其中綠豆(C0692)和小綠豆(C0754)之間的遺傳相系數(shù)為1.0，但該類群品種整體上與其他參試品種間的遺傳相似度較低，遺傳差異較大。聚類分析結(jié)果顯示，大部分來(lái)自同一地理區(qū)域的品種都成簇分布，如柳河縣綠豆品種除小綠豆(C0753)和小綠豆(C0754)外其余均聚集在第Ⅱ大類群的第Ⅱ亞群內(nèi)，其他來(lái)自于同一地區(qū)的種質(zhì)也呈現(xiàn)類似情形，如長(zhǎng)春市綠豆品種，除GCM8703-H-3(C4448)、GCM8703-H-3(C4449)和GCM8806-7-2(C4459)聚集在第二大類群第二亞類內(nèi)，其余10份均聚集在類群Ⅰ中。但同一地理來(lái)源的品種并沒(méi)有完全聚在一起，不同地理來(lái)源品種相互交叉聚在一起，這可能是因?yàn)榧质【G豆種質(zhì)來(lái)源于共同的祖先，品種間親緣關(guān)系較近，也可能是由于在長(zhǎng)期種植生產(chǎn)中優(yōu)良品種的頻繁交流造成的。同時(shí)，各類群中都存在不同品種在遺傳相似系數(shù)為1.0的水平上聚為一類的情況，這也再次說(shuō)明吉林省綠豆資源不夠豐富，品種間遺傳差異較小，遺傳相似度較高。

圖2 基于SSR標(biāo)記的74份綠豆聚類分析結(jié)果

2.4 DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及分子身份證構(gòu)建

利用9對(duì)SSR引物對(duì)74份綠豆材料進(jìn)行擴(kuò)增，部分毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖3和圖4所示。整理電泳峰圖，在同一峰值處有帶記為1，無(wú)帶記為0，建立起吉林省74個(gè)綠豆品種的DNA指紋圖譜。按表2引物順序，將每對(duì)引物在74份綠豆品種中檢測(cè)的等位基因按其片段大小升序排列并依次編號(hào)，將9對(duì)引物在每個(gè)樣品中檢測(cè)到數(shù)據(jù)的編號(hào)串聯(lián)起來(lái)，即得到由9位數(shù)字(有雜合帶時(shí)則多于9位)構(gòu)成的分子身份證。部分綠豆品種的SSR指紋圖譜及分子身份證見(jiàn)表3。

圖3 鸚哥豆(C0700)在標(biāo)記座位GBssr-MB91上的毛細(xì)管電泳峰圖

圖4 小綠豆(C0771)在標(biāo)記座位VR040上的毛細(xì)管電泳峰圖 表3 74個(gè)品種在9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記上的指紋數(shù)據(jù)及分子身份證

庫(kù)編號(hào)名稱指紋數(shù)據(jù)分子身份證C0692綠豆010-0001-01-10-000100-000001000-1000-00001-00010242146154C0693吉豆010-0010-10-01-000001-000000100-0100-01000-00100231267223C0694大綠豆010-0011-10-11-010001-010001000-0110-01010-1000023/411/22/62/62/32/41C0700鸚哥豆010-0010-10-01-100000-000000100-0010-01000-10000231217321C0701小明粒010-0010-10-01-100000-000000100-0010-01000-10000231217321C0702小綠豆010-0010-10-01-100000-000000100-0010-01000-10000231217321C0703大綠豆010-0010-01-10-010000-010000000-0100-00010-00010232122244C0704大粒豆010-0010-10-01-100000-000000100-0010-01000-10000231217322C0705小鸚哥豆010-0010-01-10-010000-010000000-0100-00010-00010232122244C0706小鸚哥豆010-0010-10-10-100000-*-1001-00001-0100023111-322C0707小綠豆010-0010-01-10-010000-010000000-0100-00010-*23212224-C0708小綠豆010-0010-10-01-100000-010000000-0001-00100-10000231212431C0709大眼綠豆010-0010-01-10-010000-010000000-0100-00010-00001232122245C0726小綠豆010-0010-01-10-000010-010000000-0010-01000-01000232152322C0729小綠豆010-0010-10-01-100000-000100000-0010-00010-01000231214342

注：*表示未檢測(cè)到等位基因。

3 討論與結(jié)論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)因其多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等顯著特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建研究中[16-17]。此外，SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中，利用DNA測(cè)序儀建立的熒光標(biāo)記SSR毛細(xì)管電泳檢測(cè)法高效、精確、靈敏度高，可獲得目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的自動(dòng)化收集與處理，克服了銀染法的不足，能夠區(qū)分識(shí)別大小相差1～2個(gè)堿基片段間差異，更加適用于大批量品種的檢測(cè)[18]。高源等[19]、王瑞等[20]、程本義等[21]分別利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)對(duì)梨、高粱及水稻進(jìn)行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建，均得出上述結(jié)論。本研究利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管技術(shù)，對(duì)吉林省74個(gè)綠豆品種進(jìn)行檢測(cè)，可直接讀取檢測(cè)片段大小，數(shù)據(jù)更加精確，遺傳多樣性分析及指紋圖譜數(shù)據(jù)也更加客觀可靠。

本研究利用9對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物對(duì)吉林省74份綠豆品種進(jìn)行分析，共檢測(cè)到40個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因2～9個(gè)，平均為4.44個(gè)；多態(tài)信息含量PIC值變化范圍介于0.076 8～0.725 4之間，平均為0.45。Li等[22]利用15對(duì)多態(tài)性引物對(duì)來(lái)自中國(guó)、韓國(guó)、日本、阿富汗、烏茲別克斯坦及尼加拉瓜等6個(gè)國(guó)家的66份綠豆種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均等位基因數(shù)為3.5個(gè)，平均PIC值為0.31；Lestari等[23]利用30對(duì)引物檢測(cè)了83個(gè)綠豆品種，平均等位基因數(shù)為2.77，平均PIC值為0.33；王麗俠等[24]利用26對(duì)小豆SSR引物對(duì)國(guó)內(nèi)外60個(gè)綠豆品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，檢測(cè)到的等位基因數(shù)從2～7個(gè)不等，平均為2.9個(gè)，PIC值從0.02～0.69不等，平均為0.36。而本研究得到的平均等位基因數(shù)和平均PIC值均高于前人研究，說(shuō)明篩選得到的引物多態(tài)性較豐富，檢測(cè)能力較強(qiáng)。同時(shí)，引物X46和X55的等位基因數(shù)(6，9)和PIC值(0.690 9，0.760 1)均較高，是吉林省綠豆種質(zhì)研究中的骨干引物，這對(duì)于充分發(fā)掘吉林省乃至中國(guó)綠豆資源微衛(wèi)星多態(tài)性信息十分有利。

遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，74個(gè)綠豆品種的遺傳相似系數(shù)變幅介于0.111 1～1.000 0之間，平均為0.499 0。其中青綠豆(C0713)和綠豆(C0692)之間遺傳相似系數(shù)最小，為0.111 1，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。遺傳相似系數(shù)在0.5以上的有1 260個(gè)，占全部數(shù)據(jù)的46.64%；而在0～0.25之間的遺傳相似系數(shù)僅有73個(gè)，占全部數(shù)據(jù)的2.70%，說(shuō)明吉林省綠豆種質(zhì)資源遺傳多樣性水平較低，遺傳背景狹窄，品種間差異較大的品種數(shù)量較少。同時(shí)，10組(37個(gè))綠豆品種在遺傳相似系數(shù)為1.0的水平上聚為一類，說(shuō)明這幾組品種間的遺傳背景相同，但不排除“同種異名”現(xiàn)象。聚類分析顯示，吉林省綠豆種質(zhì)資源遺傳相似程度較高，遺傳背景比較相近，很多資源難以完全區(qū)分，需要篩選更多的多態(tài)性引物，同時(shí)也反映出吉林省綠豆種質(zhì)資源遺傳背景較狹窄?？赡苁且?yàn)榧质【G豆資源在長(zhǎng)期生產(chǎn)活動(dòng)中種質(zhì)交流頻繁，遺傳背景比較單一，而遺傳差異較大的資源并沒(méi)有很好的在生產(chǎn)中利用。因此今后應(yīng)加強(qiáng)引進(jìn)國(guó)內(nèi)外其他資源豐富地區(qū)的材料以拓寬吉林省綠豆資源遺傳背景，加強(qiáng)種質(zhì)創(chuàng)新及新基因挖掘。

指紋圖譜及分子身份證的構(gòu)建是品種鑒定的重要途徑，是防止假冒偽劣品種進(jìn)入市場(chǎng)及名優(yōu)品種保護(hù)的有效手段[25-27]。本研究所構(gòu)建的74個(gè)綠豆品種的SSR指紋圖譜可視為吉林省綠豆SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的初步構(gòu)建，而分子身份證將SSR指紋數(shù)據(jù)數(shù)字化，更加直觀方便，應(yīng)用性較強(qiáng)，可為新品種權(quán)保護(hù)提供支持。然而其中部分品種間遺傳相似系數(shù)達(dá)到1.0，說(shuō)明這些品種在DNA水平上的差異較小，需要更多的核心引物才能將其完全區(qū)分。隨著吉林省綠豆品種數(shù)量增加，指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)也要不斷擴(kuò)充更新，因此在接下來(lái)的研究中應(yīng)大力開發(fā)綠豆SSR引物，增加構(gòu)建圖譜的SSR引物數(shù)目，從而使數(shù)據(jù)庫(kù)更加完善，以滿足不斷變化的實(shí)際需要。

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