馮金芳，何海汛，孫國鵬* ，王選年*

(1.河南科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003;2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/生物技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng)453003)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一種以法氏囊組織為感染靶器官的急性高度傳染性疾病，該病易在2～14周齡雞中發(fā)生，特別是對法氏囊組織尚未退化的雛雞危害極為嚴(yán)重，嚴(yán)重破壞感染雞的中樞免疫器官法氏囊組織［1］。目前，盡管有相應(yīng)的疫苗對其進(jìn)行防控，但由于病毒變異、環(huán)境因素等多種因素影響，導(dǎo)致近年來該病出現(xiàn)了一些新的病理特征和分子流行病學(xué)特征，給養(yǎng)殖業(yè)帶來日益嚴(yán)重的危害。

傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是副黃黏病毒的一種，屬于雙鏈RNA病毒。病毒顆粒呈二十面立體對稱的空間三維結(jié)構(gòu)［2-5］，組成該類病毒基因組的RNA共分為2個片段，分別編碼不同的功能區(qū)域，按基因組功能可以分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)［6-9］。編碼區(qū)由A、B 2個基因片段組成，A片段編碼區(qū)編碼前體多聚蛋白NH2－pVP2－VP4－VP3－COOH(分子質(zhì)量約為 110 ku)，翻譯加工形成512個氨基酸組成的多聚VP2外殼蛋白、242個氨基酸的VP4蛋白和256個氨基酸的VP3蛋白。非編碼區(qū)域主要存在于RNA片段的兩端，在編碼A片段基因的兩端分別有96 bp和134 bp大小的非編碼序列，編碼B片段的基因兩端分別有79 bp和111 bp大小的非編碼序列，且這些非編碼片段相互之間存在堿基互補(bǔ)的特點(diǎn)。這種互補(bǔ)序列可以形成發(fā)夾式構(gòu)象，能使RNA穩(wěn)定存在，與RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有關(guān)［5］。

前人研究認(rèn)為，組成IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白主要有5種，分別為分子質(zhì)量約90 ku的 VP1、約40 ku的VP2、約35 ku的 VP3、約 29 ku的 VP4和 17 ku的VP5。VP2蛋白是血清特異性抗原，單獨(dú)VP2蛋白即可誘導(dǎo)雞成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，是決定IBDV毒力的主要因子［6］。VP2蛋白在致病性上起著決定性的作用，也是引起宿主細(xì)胞凋亡的主要因子之一。在VP2蛋白的第206—350位氨基酸區(qū)域稱為VP2高變區(qū)，整個親水區(qū)的變異決定著病毒毒力的大小、抗原性的改變，甚至是新型變異株的出現(xiàn)［7］。而且，VP2蛋白在可變區(qū)內(nèi)含有與毒力相關(guān)的抗原表位，屬于中和性表位，有毒力特異性，能區(qū)分IBDV強(qiáng)毒株和弱毒株［8-11］。因此，VP2蛋白的高變區(qū)是基因工程疫苗的重點(diǎn)研究對象。本研究擬通過對1株分離于新鄉(xiāng)地區(qū)某雞場的IBDV毒力相關(guān)基因VP2進(jìn)行克隆，與GenBank中公布的IBDV主要流行毒株VP2高變區(qū)，特別是與毒力相關(guān)的2個親水區(qū)和1個七肽區(qū)進(jìn)行比對分析，研究IBDV分離毒株的分子流行病學(xué)特征，旨在為IBD的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動物病料來源與處理

采集新鄉(xiāng)地區(qū)某雞場疑似IBDV感染病雞的法氏囊組織，低溫保存。取1 g采集到的法氏囊組織并剪碎，研磨成勻漿，再加入5倍體積PBS緩沖液混勻，凍融3次，1 000×g離心10 min，收集上清液。

1.2 主要儀器和試劑

微量蛋白核酸分析儀為Nano Vue公司產(chǎn)品;低溫高速離心機(jī)為Thermo Fisher公司產(chǎn)品;PCR儀由BIOMETRA生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO－RAD公司產(chǎn)品;Trizol LS試劑為 Invitrogen公司產(chǎn)品;rTaq聚合酶為 TaKaRa公司產(chǎn)品;DL2000 DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品;IBDV快速檢測試紙條由河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 法氏囊組織總RNA的提取和VP2高變區(qū)的PCR擴(kuò)增

參照上海生工生物技術(shù)公司RNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行法氏囊組織RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后根據(jù)雞法氏囊病毒VP2核苷酸序列，采用DNAStar軟件設(shè)計引物，用于擴(kuò)增VP2高變區(qū)，理論設(shè)計擴(kuò)增長度為593 bp，引物序列為VP2－1:5'－TGATCTTGGGTATGTGAGG－3';VP2－2:5'－GCTAGTTCAGGATTTGGGAT－3'，將序列發(fā)送到上海生工生物技術(shù)公司合成。

以法氏囊組織cDNA為模板，對IBDV VP2高變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系:2.5 μL 10×Buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.5 μL rTaq，1.0 μL 10 μmol/L上、下游引物，1.0 μL cDNA，補(bǔ)加 ddH2O 至總體積25.0 μL?；靹蚝笏矔r離心，置PCR儀中進(jìn)行反應(yīng):94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR反應(yīng)完成后取5 μL樣品電泳檢測(0.5 μg/μL EB 染色)。同時取適量 PCR產(chǎn)物寄至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與國內(nèi)部分經(jīng)典毒株進(jìn)行基因同源性分析。

1.4 IBDV分離毒株VP2高變區(qū)的分子流行病學(xué)分析

用MEGA 6.0軟件將VP2基因序列翻譯成氨基酸序列，將翻譯后的氨基酸序列與河南地區(qū)的主要IBDV流行毒株及經(jīng)典毒株進(jìn)行VP2高變區(qū)對比分析，繪制進(jìn)化樹。

IBDV主要流行毒株具體信息見表1。

表1 IBDV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 IBDV分離毒株VP2高變區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖1可以看出，在593 bp處有特異性條帶出現(xiàn)，與預(yù)期擴(kuò)增大小一致。表明分離毒株為IBDV，且成功克隆其VP2高變區(qū)。

圖1 IBDV VP2高變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

2.2 IBDV分離毒株VP2高變區(qū)的分子流行病學(xué)分析

2.2.1 VP2高變區(qū)氨基酸序列推導(dǎo)及同源性分析測序結(jié)果進(jìn)一步表明，分離毒株為IBDV，將其命名為XX511。采用MEGA 6.0軟件將測序的基因序列翻譯為氨基酸序列(圖2)。同源性分析結(jié)果顯示，XX511毒株與超強(qiáng)毒株D49706、AJ878898的同源性均為 96.8%，與超強(qiáng)毒株 AF499929、弱毒株X16107 的同源性分別為 95.8%、96.3%，與廣東地區(qū)JQ911703毒株具有100%的同源性。

圖2 IBDV XX511毒株VP2高變區(qū)DNA序列及其推導(dǎo)氨基酸序列

2.2.2 VP2高變區(qū)氨基酸序列比對結(jié)果 為明確XX511毒株VP2高變區(qū)的氨基酸變異情況，分析XX511毒株基因序列、部分IBDV經(jīng)典毒株和河南地區(qū)部分流行毒株基因序列，比較其氨基酸不同位點(diǎn)。從XX511毒株與經(jīng)典毒株及河南地區(qū)流行毒株VP2高變區(qū)序列比對結(jié)果可以看出，XX511毒株在217位變異明顯，由S變異為L(表2、表3)。將XX511毒株與經(jīng)典毒株七肽區(qū)序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，僅第5位氨基酸與X16017、AF499929毒株不一致(表4)。由以上結(jié)果可以得出，分離毒株XX511的抗原性基本未發(fā)生變化，具備正常的致病力，但是217位氨基酸的變化可能會改變XX511毒株的毒力。

表2 XX511毒株與經(jīng)典毒株VP2高變區(qū)序列比較

表3 XX511毒株與河南地區(qū)流行毒株VP2高變區(qū)序列比較

表4 XX511毒株與經(jīng)典毒株七肽區(qū)序列比較

2.2.3 VP2親水區(qū)序列比對結(jié)果 氨基酸212D—224G是第一親水區(qū)，該區(qū)域?qū)P2蛋白的穩(wěn)定性具有重要作用;氨基酸314T—324Q是第二親水區(qū)，屬于誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體的抗原表位。由表5、表6可知，第一親水區(qū)僅217位點(diǎn)變異明顯，第二親水區(qū)氨基酸位點(diǎn)均未發(fā)生變化?？梢姡琗X511毒株的抗原決定簇和穩(wěn)定性與經(jīng)典毒株不同，發(fā)生變異是導(dǎo)致毒力加強(qiáng)的主要原因，而中和抗原表位與經(jīng)典毒株相同，未發(fā)生變異。

表5 XX511毒株與經(jīng)典毒株的第一親水區(qū)氨基酸比較

表6 XX511毒株與經(jīng)典毒株的第二親水區(qū)氨基酸比較

2.2.4 XX511毒株與國內(nèi)外毒株進(jìn)化樹分析 為了確定XX511與其他毒株的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件計算并分析XX511毒株VP2高變區(qū)氨基酸序列與國內(nèi)其他毒株VP2高變區(qū)氨基酸序列，得到不同IBDV毒株的進(jìn)化關(guān)系(圖3)。從圖3可見，與XX511毒株在同一分支的超強(qiáng)毒株有JQ911703。

圖3 基于XX511毒株VP2高變區(qū)氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，為保證采集到的法氏囊組織為IBDV感染致病組織，采用IBDV病毒快速檢測試紙條對采集到的病料進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，采集法氏囊組織研磨液樣品出現(xiàn)了明顯的陽性條帶，說明采集的法氏囊組織為IBDV感染致病組織。

利用RT－PCR技術(shù)從分離的毒株中成功克隆XX511毒株VP2高變區(qū)基因。分離到的毒株與超強(qiáng)毒株均有較高的同源性，XX511毒株與超強(qiáng)毒株D49706、AJ878898 的同源性均為96.8%。

超強(qiáng)毒株VP2高變區(qū)基因序列主要特征有:VP2高變區(qū)中的丙氨酸(222)、谷氨酰胺(249)、甘氨酸(254)、天冬氨酸(279)、丙氨酸(284)、異亮氨酸(294)、絲氨酸(299)及七肽區(qū)的絲氨酸、色氨酸、絲氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、絲氨酸高度保守［12-14］，這些因素保證了超強(qiáng)毒株的抗原性、致病力和毒力。同時有研究表明，高變區(qū)與2個親水區(qū)之間還存在3個小的親水部位，分別位于248—252位氨基酸、279—290位氨基酸、299—305位氨基酸，它們的變異會使抗原性或毒力發(fā)生變化［15-16］。從XX511毒株和經(jīng)典毒株VP2高變區(qū)序列比對結(jié)果可以看出，XX511毒株在217位變異明顯，由S變異為L。XX511毒株與河南地區(qū)流行毒株VP2高變區(qū)序列比較結(jié)果得出，XX511毒株在217位氨基酸變異最明顯。從XX511毒株和經(jīng)典毒株七肽區(qū)序列比較結(jié)果可知，僅第 5位氨基酸與 X16017和AF499929毒株不一致。河南省的流行毒株均為強(qiáng)毒株［17-20］，而XX511毒株則表現(xiàn)出不同的分子流行病學(xué)特征，表明IBDV在河南地區(qū)的流行特征發(fā)生了一些不同的變化。

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