王菊鳳，李鵠鳴，楊道德

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首416000;2.中南林業(yè)科技大學(xué)野生動(dòng)植物保護(hù)研究所，湖南長(zhǎng)沙410004)

蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥用真菌，為子囊菌亞門麥角菌目麥角菌科蟲(chóng)草屬的模式種。蛹蟲(chóng)草中含有大量的蟲(chóng)草素、腺苷和蟲(chóng)草多糖，其特殊的醫(yī)療保健功能已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外專家的高度重視。蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖是目前衡量蛹蟲(chóng)草品質(zhì)的重要指標(biāo)［1］，同時(shí)也是臨床應(yīng)用的主要功能因子［2］，近年來(lái)已成為蟲(chóng)草領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

微量元素在藥用真菌栽培中具有重要作用，主要是通過(guò)真菌菌絲體的富集能力，對(duì)藥用真菌本身活性物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響，或者與之結(jié)合，從而增加藥用真菌的營(yíng)養(yǎng)保健功能。硒是目前已知的14種人體必需的微量元素之一，被譽(yù)為“抗癌之王”，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)利用生物轉(zhuǎn)化法富集硒進(jìn)行了大量研究［3］。微量元素鍺的有機(jī)化合物，在人類的生命過(guò)程中起著重要的作用，并與人體健康有著密切的關(guān)系。天然有機(jī)鍺是許多藥用植物的有效成分之一。眾所周知的人參和其他藥用植物，如枸杞、靈芝、當(dāng)歸、黃芪等之所以具有獨(dú)特的強(qiáng)身滋補(bǔ)等保健功能，除了與它們的主要活性成分有關(guān)以外，還與它們都富含的有機(jī)鍺有關(guān)。除此以外，有機(jī)鍺還具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。因此，含鍺生物的轉(zhuǎn)化研究逐漸成為微量元素研究范圍內(nèi)較為活躍的領(lǐng)域［4-5］。

目前，關(guān)于微量元素硒、鍺對(duì)蛹蟲(chóng)草活性物質(zhì)影響的研究較少。特別是硒、鍺對(duì)蛹蟲(chóng)草的協(xié)同效應(yīng)還未見(jiàn)報(bào)道。為此，以固體培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體作為富硒、鍺的載體，研究不同質(zhì)量濃度的硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同質(zhì)量濃度的硒鍺組合對(duì)子實(shí)體內(nèi)蟲(chóng)草素、腺苷和蟲(chóng)草多糖含量的影響，為獲得蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖高含量的菌株提供候選資源，為富硒鍺蛹蟲(chóng)草的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試蛹蟲(chóng)草菌株CM－C由中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供。

1.1.2 斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g(煮汁)、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，自然pH值。

1.1.3 固體基本培養(yǎng)基 含大米 83%、玉米粉10%、白砂糖2%、蛋白胨2%、蠶蛹粉2.5%、硫酸鎂0.2%、檸檬酸銨 0.2%、磷酸二氫鉀 0.1%、維生素 B1微量(1 L水加5～6片)、水，pH 值5～7。

1.2 方法

1.2.1 樣品培養(yǎng) 首先選擇Na2SeO3質(zhì)量濃度依次為 5、10、15 mg/L，GeO2質(zhì)量濃度依次為 100、200、300、400 mg/L，按照表1正交設(shè)計(jì)配制成12個(gè)硒鍺組合質(zhì)量濃度組，然后分別添加在基本培養(yǎng)基中。常規(guī)滅菌，常規(guī)接種，對(duì)照組使用基本培養(yǎng)基，每個(gè)質(zhì)量濃度組重復(fù)處理50瓶，按常規(guī)瓶栽法培養(yǎng)及管理，置于18～23℃、空氣相對(duì)濕度85%～95%、光照強(qiáng)度300～400 lx、通風(fēng)良好的環(huán)境條件下培養(yǎng)。1個(gè)生長(zhǎng)周期即將結(jié)束時(shí)，分別采收子實(shí)體，每個(gè)質(zhì)量濃度選取10瓶生長(zhǎng)典型的蟲(chóng)草，首先記錄蟲(chóng)草的根數(shù)，再用游標(biāo)卡尺測(cè)量每根蟲(chóng)草的長(zhǎng)度，最后綜合10瓶蟲(chóng)草的平均值，得到子實(shí)體的平均長(zhǎng)度。同樣每個(gè)質(zhì)量濃度選取10瓶生長(zhǎng)典型的蟲(chóng)草，分別稱鮮質(zhì)量，再稱干質(zhì)量。

表1 硒鍺正交設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度設(shè)置 mg/L

1.2.2 蟲(chóng)草素和腺苷的提取分離和純化 取蛹蟲(chóng)草子實(shí)體于65℃下干燥，粉碎，過(guò)篩［孔徑(180±7.6)μm］。精確稱取蟲(chóng)草粉1 g，加蒸餾水25 mL，于95℃下水浴保溫1 h，過(guò)濾;濾渣再加入蒸餾水25 mL，于95℃下水浴保溫1 h，過(guò)濾，合并2次濾液，冷卻，50 mL容量瓶定容，用于測(cè)定蟲(chóng)草素和腺苷含量。

1.2.3 蟲(chóng)草素和腺苷含量的測(cè)定 測(cè)定條件完全按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。用LC－2010CHT高效液相色譜儀(德國(guó)制造)測(cè)定，以乙腈－水(7∶93)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，蟲(chóng)草素和腺苷標(biāo)樣均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。上述1.2.2中樣品溶液經(jīng)微孔濾膜(0.50 μm)過(guò)濾作樣品溶液。用外標(biāo)法計(jì)算樣品中蟲(chóng)草素和腺苷的含量。

1.2.4 蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定 樣品制備:蛹蟲(chóng)草子實(shí)體在65 ℃下干燥，粉碎，過(guò)篩［孔徑(180±7.6)μm］。準(zhǔn)確稱取蟲(chóng)草粉1 g，加30 mL蒸餾水在95℃下保溫1 h提取多糖，冷卻過(guò)濾，保存濾液，濾渣再加水30 mL重復(fù)上述過(guò)程2次。合并3次提取的濾液，定容至100 mL。

采用苯酚－硫酸法［6］測(cè)定多糖的含量。精確吸取樣品處理液1.0 mL，置于10 mL比色管中，加蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL?？瞻讓?duì)照管則用蒸餾水。樣品管和空白管中加入6%的苯酚溶液1.0 mL，搖

勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，在室溫下放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于490 nm處，以空白校正零點(diǎn)，用1 mL比色皿測(cè)吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)情況的影響

表2顯示不同質(zhì)量濃度硒鍺組合處理對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體顏色與長(zhǎng)勢(shì)、子實(shí)體形態(tài)、平均長(zhǎng)度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等生長(zhǎng)情況的影響。圖1為不同質(zhì)量濃度硒鍺組合處理后蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)形態(tài)比較。其中子實(shí)體均為生長(zhǎng)20 d的長(zhǎng)勢(shì)。不論是哪個(gè)質(zhì)量濃度的硒鍺組合，其子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育都很健壯旺盛，絕大部分都呈金黃色，而且要比對(duì)照組粗壯、色深。從表2可知，如果只考慮硒的濃度，從子實(shí)體形態(tài)來(lái)看，低硒濃度組子實(shí)體生長(zhǎng)較粗壯，與對(duì)照組相比較其平均長(zhǎng)度或短或長(zhǎng)，而高硒濃度組子實(shí)體形態(tài)不是很有規(guī)則;但是，在生物量方面，相同條件下與對(duì)照組相比較，鮮質(zhì)量與干質(zhì)量都明顯增大，干質(zhì)量增長(zhǎng)率最高可達(dá)14.50%。說(shuō)明硒鍺組合產(chǎn)生了明顯的協(xié)同效應(yīng)，硒鍺能促進(jìn)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生物量的增加。

表2 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)情況的影響

2.2 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量的影響

由圖2可見(jiàn)，在不同質(zhì)量濃度硒鍺組合處理?xiàng)l件下，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量發(fā)生了明顯的變化，而且所有樣品處理組的蟲(chóng)草素含量全部比對(duì)照組的蟲(chóng)草素含量高。當(dāng)硒鍺組合質(zhì)量濃度為10 mg/L×300 mg/L時(shí)，子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量達(dá)到最高，為1.12%，是對(duì)照組的2.89倍;當(dāng)硒鍺組合質(zhì)量濃度為10 mg/L×400 mg/L與15 mg/L×100 mg/L 時(shí)，子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量次之，分別為1.02%和0.96%，此時(shí)也明顯高于對(duì)照組的0.387%，分別是對(duì)照組的2.64倍和2.48倍。從圖2還可以看出，隨著培養(yǎng)基中硒鍺質(zhì)量濃度的增加，蟲(chóng)草素含量首先上升，達(dá)到最高值以后開(kāi)始下降。由此可見(jiàn)，硒鍺有利于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素的合成，而且硒鍺的最適組合質(zhì)量濃度為10 mg/L×300 mg/L。方差分析得知，各試驗(yàn)組間差異顯著(P＜0.05)。

圖1 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合處理蛹蟲(chóng)草子實(shí)體形態(tài)比較

圖2 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷含量的影響

不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體內(nèi)腺苷的合成影響較大(圖3)?？偟膩?lái)說(shuō)，所有樣品處理組的腺苷含量比對(duì)照組的腺苷含量高，說(shuō)明硒鍺組合有利于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷的合成，由于腺苷是蟲(chóng)草素合成的直接前體物質(zhì)，因此，如以上分析，同樣有利于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素的合成。當(dāng)鍺質(zhì)量濃度在100～400 mg/L，子實(shí)體內(nèi)腺苷含量變化不大。當(dāng)硒質(zhì)量濃度較高為15 mg/L、鍺質(zhì)量濃度較低為100 mg/L時(shí)，子實(shí)體中腺苷含量相對(duì)最高為0.116%，是對(duì)照組的2.7倍?？芍煌|(zhì)量濃度硒鍺組合的協(xié)同效應(yīng)以高硒低鍺為宜。由方差分析得知，各試驗(yàn)組間差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷含量的影響

2.4 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草多糖含量的影響

圖4顯示了不同質(zhì)量濃度硒鍺組合處理對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草多糖含量影響的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。由于硒鍺組合的協(xié)同效應(yīng)影響，樣品處理組的蟲(chóng)草多糖含量全部比對(duì)照組的蟲(chóng)草多糖含量高，方差分析得知，各試驗(yàn)組間差異顯著(P＜0.05)。說(shuō)明硒鍺有利于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中多糖的生物合成積累。當(dāng)硒鍺組合質(zhì)量濃度為10 mg/L×200 mg/L時(shí)，多糖的合成量達(dá)到最高(5.72%)，為對(duì)照組(2.96%) 的1.93倍。從圖4還可以看出，當(dāng)鍺質(zhì)量濃度在100～400 mg/L，隨著培養(yǎng)基中鍺質(zhì)量濃度的增加，蟲(chóng)草多糖含量開(kāi)始時(shí)明顯增加，但與硒產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)時(shí)，蟲(chóng)草多糖含量又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，推測(cè)這種現(xiàn)象可能是由于硒濃度的增加致使蟲(chóng)草多糖的合成受到制約的緣故。

圖4 不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草多糖含量的影響

3 結(jié)論與討論

蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖是蟲(chóng)草屬真菌特異性合成的2種次生代謝產(chǎn)物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)心肺等功能［7-8］。蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖的含量及其開(kāi)發(fā)利用是目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容［9-10］，腺苷是初生代謝產(chǎn)物，是蟲(chóng)草素合成的直接前體物質(zhì)，其本身也具有很好的生理活性［11］。

從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同質(zhì)量濃度硒鍺組合處理組蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育健壯旺盛，色深、粗壯，生物量明顯大于對(duì)照組;而且蟲(chóng)草素、腺苷和蟲(chóng)草多糖的含量都顯著增高。說(shuō)明不同質(zhì)量濃度硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素、腺苷和蟲(chóng)草多糖的產(chǎn)生都有不同程度的促進(jìn)作用，特別是對(duì)蟲(chóng)草素的影響最大，最高達(dá)到了對(duì)照組的2.89倍。相關(guān)的研究顯示，單因素硒(質(zhì)量濃度為5.5 mg/L)處理蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素的含量是空白組的1.21倍［12］;單因素鍺(質(zhì)量濃度為300 mg/L)處理蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素的含量是空白組的 1.09 倍［5］，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示的 2.89 倍已經(jīng)明顯超過(guò)了以上硒、鍺單獨(dú)試驗(yàn)之和(1.21+1.09=2.30)。由此說(shuō)明，硒鍺組合對(duì)蟲(chóng)草素的影響表現(xiàn)出顯著的協(xié)同正效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，硒鍺組合使多糖的合成量達(dá)到對(duì)照組的1.93倍，顯著高于硒、鍺對(duì)蟲(chóng)草多糖的單獨(dú)影響結(jié)果，硒鍺組合同樣表現(xiàn)出明顯的協(xié)同正效應(yīng)。因而硒鍺有利于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中主要生理活性物質(zhì)的合成與積累。因此，完全可以在培養(yǎng)基中同時(shí)加入硒鍺來(lái)生產(chǎn)合成這些主要的生理活性物質(zhì)，而且還可以通過(guò)生物量的指標(biāo)快速篩選出子實(shí)體階段高蟲(chóng)草素和高蟲(chóng)草多糖含量的菌株，因而拓展了蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖的開(kāi)發(fā)利用途徑。

關(guān)于硒鍺是如何影響蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育以及促進(jìn)主要生理活性物質(zhì)的生物合成，筆者推測(cè)，硒鍺作為真菌生長(zhǎng)不可缺少的微量元素能夠刺激菌絲的生長(zhǎng)，促使子實(shí)體形態(tài)的構(gòu)成以及影響細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和能量代謝，例如，直接增加腺苷的含量，從而促進(jìn)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的增加;并通過(guò)類似的機(jī)制促進(jìn)了蟲(chóng)草多糖的合成［13］。還有一種可能是，硒鍺離子的加入使得某些被刺激的酶和基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子影響了蟲(chóng)草素的合成，對(duì)此現(xiàn)象的機(jī)制還需深入研究［9，14］。

從試驗(yàn)結(jié)果還可看到，高質(zhì)量濃度的硒鍺組合對(duì)蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖含量所表現(xiàn)出來(lái)的協(xié)同效應(yīng)沒(méi)有低質(zhì)量濃度的明顯，可能是高質(zhì)量濃度的硒鍺組合對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的抑制作用，從而對(duì)生理活性物質(zhì)的形成產(chǎn)生一定的影響。因此，在硒、鍺作為微量元素添加時(shí)均以低質(zhì)量濃度為宜。另外，本試驗(yàn)中所測(cè)得的腺苷最高含量是在硒質(zhì)量濃度為15 mg/L、鍺質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，因此對(duì)腺苷而言，高硒低鍺條件下兩者的協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮得最好。這一條件也有可能成為獲得高產(chǎn)量蟲(chóng)草素的另一途徑。

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