吾布力卡斯木·吾拉木 巴突爾·艾克木 買買提·依斯熱依力 劉曉勇克力木·阿不都熱依木，3

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）依據(jù)內(nèi)鏡表現(xiàn)可分為3種類型：非糜爛性反流?。╪onerosive reflux disease，NERD）、糜爛性食管炎（erosive esophagitis，EE）和Barrett食管（Barrett esophagus，BE）［1-3］。最新研究［4］證實(shí)人類GERD的發(fā)生并不是反流物直接“酸蝕”的結(jié)果，而是率先從細(xì)胞因子介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞組織浸潤(rùn)開始，進(jìn)而發(fā)展引起食管黏膜細(xì)胞間隙增寬、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及食管基底細(xì)胞乳突狀增生等組織學(xué)變化。目前T淋巴細(xì)胞的遷移及其對(duì)GERD進(jìn)展的具體機(jī)制尚不明確。有報(bào)道指出，Th2細(xì)胞（type 2 T helper cells）通過細(xì)胞因子途徑對(duì)BE的發(fā)展具有重要作用［5-6］，BE組織中Th2細(xì)胞因子表達(dá)升高可激活特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而引起抗凋亡基因的表達(dá)導(dǎo)致凋亡的抑制［7］。本研究擬從Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-6入手，探索GERD（NERD、RE、BE）中代表性的細(xì)胞因子并評(píng)價(jià)其黏膜中病理組織學(xué)變化特點(diǎn)。

資料與方法

一、對(duì)象

選自2016年12月至2017年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院住院患者69例，經(jīng)Gerd Q相關(guān)癥狀量表評(píng)分［8］、食管24 h pH監(jiān)測(cè)評(píng)估是否符合胃食管反流病（及其亞型）診斷標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合纖維胃鏡檢查結(jié)果將其進(jìn)行以下分組：BE組、EE組、NERD組及對(duì)照組。其中對(duì)照組選取Gerd Q相關(guān)癥狀評(píng)分表評(píng)分＜6分，因胃食管黏膜異位癥、食管靜脈瘤等其他消化道疾病行內(nèi)鏡檢查，而內(nèi)鏡及免疫學(xué)診斷無(wú)食管黏膜炎癥損害的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～70歲；（2）胃鏡檢查未發(fā)現(xiàn)食管、胃占位性病變（對(duì)照組除外）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）食管鱗狀上皮癌、食管腺癌等上消化道惡性病變；（2）有上消化道手術(shù)或開胸手術(shù)史者；（3）檢查前1個(gè)月內(nèi)有促胃動(dòng)力藥物、質(zhì)子泵抑制劑或H2受體拮抗劑等藥物服用史者；（4）懷孕或哺乳期婦女。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1.儀器：石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leitz公司；TC-120智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；TB-718E型組織包埋機(jī)，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；光學(xué)顯微鏡（Eclipse E200），日本尼康公司；-20℃/4℃低溫冰箱（青島海爾公司）；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；無(wú)水乙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；二甲苯，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；包埋石蠟，上海懿洋儀器有限公司；蘇木素，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；伊紅，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人IL-4、IL-6抗體，美國(guó)Abcam公司；免疫組化試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

2.方法：食管組織標(biāo)本均取自新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心，于纖維胃鏡下夾取食管齒狀線以上3 cm處（BE及EE組選取病變明顯部位）組織，置于4%中性甲醛液中固定，用于后期包埋蠟塊，行HE與免疫組化染色使用。

三、觀測(cè)指標(biāo)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

選擇BE、EE、NERD 3種不同亞型胃食管反流病患者作為研究對(duì)象，無(wú)反流相關(guān)疾病者為對(duì)照組，通過食管24 h pH監(jiān)測(cè)比較其食管反流特點(diǎn)；對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色后根據(jù)食管組織炎癥評(píng)價(jià)方法［9］進(jìn)行評(píng)分；免疫組化法檢測(cè)研究對(duì)象食管黏膜中IL-4與IL-6的表達(dá)后進(jìn)行陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：IL-4、IL-6表達(dá)于細(xì)胞核或（和）細(xì)胞漿，著色棕黃色為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行歸類：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為（-），5%～25%為（＋），＞25%～50%為（＋＋），＞50%為 （＋＋＋）［10］，結(jié)果中 （＋）、（＋＋）、（＋＋＋）的總和稱陽(yáng)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 23.0軟件對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組件比較采用方差分析檢驗(yàn)比較組間差異；非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）描述，使用秩和檢驗(yàn)比較組間差異；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者基本情況

根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、Gerd Q評(píng)分及內(nèi)鏡檢查等結(jié)果，將其分為3亞組和1對(duì)照組：BE組21例，其中男性13例，女性8例，平均年齡（45.72±13.55）歲；EE組25例，其中男性14例，女性11例，平均年齡（52.73±10.4）歲；NERD組13例，其中男性6例，女性7例，平均年齡（49.20±14.76）歲；對(duì)照組10例，其中男性14例，女性11例，平均年齡（53.50±9.86）歲。性別分布方面BE組與EE組男性占比略高于其余2組；4組患者一般指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

二、DeMeester評(píng)分及食管反流事件分析

食管24 h pH監(jiān)測(cè)中DeMeester評(píng)分3組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NERD組pH≤4（酸反流）次數(shù)較其余2組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；盡管BE組在4＜pH＜7（弱酸反流）總次數(shù)、反流事件總次數(shù)的比較中略高于EE組和NERD組，但3組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

三、組織學(xué)特點(diǎn)

GERD患者食管黏膜上皮有不同程度增厚，棘層上皮細(xì)胞數(shù)量增加，上皮及黏膜固有層可見炎癥細(xì)胞不同程度增加，以EE和BE組尤為明顯。對(duì)照組食管黏膜上皮完整，細(xì)胞排列規(guī)則整齊，未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；EE組上皮細(xì)胞可見水腫，上皮細(xì)胞間隙增寬，乳突延長(zhǎng)，此特點(diǎn)在部分NERD患者中同樣存在但并不顯著；BE組上皮破壞明顯，水腫及基底層增生顯著，組織內(nèi)浸潤(rùn)的細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和一些嗜酸性粒細(xì)胞。4組黏膜組織病理學(xué)評(píng)分BE組與EE組與其余2組相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），BE組評(píng)分與EE組之間亦有顯著差異（P＜0.05），NERD組與對(duì)照組間差異不明顯（圖1）。

四、IL-4、IL-6的表達(dá)

采用光鏡觀察及免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)4組食管標(biāo)本中的IL-4表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，IL-4在4組食管均有不同程度表達(dá)，其中對(duì)照組表達(dá)量最少，隨著炎癥加深I(lǐng)L-4呈現(xiàn)表達(dá)增高趨勢(shì)，但4組患者間IL-4陽(yáng)性率的比較并無(wú)顯著差異（表2）。

IL-6在4組食管中的表達(dá)呈現(xiàn)差異，在NERD組和對(duì)照組表達(dá)量較低甚至不表達(dá)，炎癥加深使IL-6表達(dá)水平升高，在4組患者食管IL-6陽(yáng)性率的比較中，EE組明顯高于對(duì)照組，但與NERD組間無(wú)顯著差異；BE組陽(yáng)性率與對(duì)照組和NERD組之間皆有明顯差異（P均＜0.05），NERD組和對(duì)照組差異亦不明顯（表2）。

表1 不同亞型GERD患者食管酸暴露比較 [M(P25,P75)]

圖1 組織炎癥評(píng)分

表2 各組食管黏膜上皮組織中IL-4和IL-6表達(dá)的比較［例（%）］

討 論

學(xué)界關(guān)于非糜爛性反流病、糜爛性食管炎和Barrett食管的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，有觀點(diǎn)認(rèn)為3者病理生理、臨床特征、自然預(yù)后等皆不同，因此互為獨(dú)立亞型而不會(huì)相互轉(zhuǎn)化［11-12］。然而大量研究也表明，它們可能是同一疾病譜（GERD）中程度遞增的病變［13-15］，Pace等［16］對(duì)33例監(jiān)測(cè)出酸反流過度的NERD患者隨訪5年后發(fā)現(xiàn)，94.4%（17/18）進(jìn)展為了EE，而在10年后幾乎全部隨訪者發(fā)展為了EE甚至BE。

本研究針對(duì)3組不同GERD亞型患者的食管24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，NERD組患者的pH＜4的酸反流次數(shù)與DeMeester評(píng)分較BE及EE組更低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管酸反流在GERD發(fā)病中的作用已受公認(rèn)，但弱酸和非酸對(duì)GERD進(jìn)展的影響尚無(wú)定論。研究表明，NERD患者pH監(jiān)測(cè)特點(diǎn)與GERD其他亞型相比，非酸反流現(xiàn)象明顯增加［17］，其反流物主要成分可能包括膽汁、胰腺分泌物等，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

組織學(xué)評(píng)價(jià)方面，本實(shí)驗(yàn)中各組GERD患者食管黏膜上皮均有不同程度增厚，炎細(xì)胞數(shù)目在BE組和EE組增加明顯，提示炎癥水平與內(nèi)鏡下糜爛表現(xiàn)相關(guān)；盡管NERD患者內(nèi)鏡檢查陰性，但在少量患者中仍發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞間隙增寬，乳突延長(zhǎng)、食管上皮水腫、棘層上皮細(xì)胞數(shù)量增加等特點(diǎn)，與先前研究報(bào)道［4］一致；Barrett食管黏膜上皮組織內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和一些嗜酸性粒細(xì)胞，類似于以往的食管炎報(bào)告［18］。

食管黏膜炎癥如同所有黏膜糜爛的特點(diǎn)一樣，主要以炎細(xì)胞（中性粒為主）浸潤(rùn)為主［19］，然而炎細(xì)胞的組織浸潤(rùn)究竟是食管炎發(fā)生的原因還是其結(jié)果目前尚無(wú)定論。2016年，Dunbar等［4］在對(duì)已治愈的GERD患者食管遠(yuǎn)端正常組織進(jìn)行活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，食管黏膜下層存在廣泛的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有基底細(xì)胞的乳突狀增生。

近來研究發(fā)現(xiàn)Th2通過細(xì)胞因子途徑對(duì)GERD的發(fā)展具有重要作用［6］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法探測(cè)3組GERD亞型及正常對(duì)照組食管標(biāo)本中的IL-6水平后發(fā)現(xiàn)，其在對(duì)照組表達(dá)量極低甚至不表達(dá)，而炎癥程度加深會(huì)使IL-6表達(dá)水平升高；BE組陽(yáng)性率與對(duì)照組和NERD組之間皆有明顯差異；NERD組IL-6表達(dá)較對(duì)照組略上升。

本研究中IL-4在4組食管均有不同程度表達(dá)，其中對(duì)照組表達(dá)量最少，隨著炎癥加深I(lǐng)L-4呈現(xiàn)表達(dá)增高趨勢(shì)；統(tǒng)計(jì)4組患者IL-4表達(dá)陽(yáng)性率后發(fā)現(xiàn)，各組間并無(wú)顯著差異；血清IL-4水平BE組和EE組均明顯高于其余兩組，與之前研究［20］相符。Barrett食管中的上皮化生被認(rèn)為是上皮細(xì)胞為應(yīng)對(duì)慢性胃食管反流作出的適應(yīng)性改變［21］，IL-4表達(dá)的升高（我們的結(jié)果）支持了這一理論即，作為抗炎性細(xì)胞因子，IL-4發(fā)揮了其細(xì)胞保護(hù)作用。

根據(jù)本次研究結(jié)果我們認(rèn)為，從缺乏內(nèi)鏡證據(jù)的NERD到炎癥表現(xiàn)明顯的糜爛性食管炎再到出現(xiàn)化生的Barrett食管，酸反流在這一進(jìn)程中并未明顯加重；NERD患者的食管黏膜上皮已出現(xiàn)病理組織學(xué)變化，但與正常組織鑒別尚缺乏敏感性；但相比于IL-4，IL-6在不同亞型GERD食管黏膜組織中的差異更為明顯。本研究受臨床資源、研究周期等因素約束，未能收集足夠多的樣本納入研究，結(jié)論尚不具有代表性，今后尚需要通過增加動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等方法，尋找更多有力的佐證以盡早探明人類胃食管反流病的發(fā)病之謎。