殷玲，吉挺，戰(zhàn)旭梅，李冠華

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇泰州 225300）（2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

蜜蜂發(fā)育會(huì)經(jīng)過卵、幼蟲、蛹到成蟲的一系列過程。由于蛻皮激素與保幼激素的作用，蜜蜂在每個(gè)發(fā)育階段必然經(jīng)歷若干次的蛻皮過程，蛻下的繭衣緊緊依附于巢房的內(nèi)壁，蜜蜂成蟲后會(huì)殘留下蛹退下的繭衣和一些排泄的物質(zhì)；同時(shí)巢房也是蜜蜂貯存食物的場所，蜂蜜、蜂膠、花粉和王漿等物質(zhì)也殘留在巢房中。因此，巢脾成分十分復(fù)雜，研究顯示蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，如多糖、有機(jī)酸、生物堿、鞣質(zhì)以及苷類等[1～3]。蜜蜂巢脾具有抑菌殺菌，殺蟲攻毒，祛風(fēng)鎮(zhèn)痛，降血壓，降血脂，抗氧化等多種生物學(xué)及藥理學(xué)價(jià)值[4～6]。我國是世界第一養(yǎng)蜂大國，養(yǎng)蜂生產(chǎn)淘汰下來的巢脾數(shù)量相當(dāng)可觀，但巢脾常被用來提取蜂蠟，而其中的其它活性物質(zhì)卻被丟棄，造成了極大的資源浪費(fèi)。同時(shí)由于對(duì)巢脾的基礎(chǔ)性研究、藥理學(xué)研究十分匱乏，巢脾的深加工推廣應(yīng)用還有很多問題，制約了巢脾制品的規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。近年來，隨著人們對(duì)天然多糖研究的深入，天然多糖所具有的調(diào)節(jié)人體免疫、抗氧化、抗腫瘤和降低固醇等各種生理功能逐漸為人們所重視[7～10]，多糖已經(jīng)開始在食品、功能性保健品和藥物等領(lǐng)域進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用[11,12]。蜜蜂巢脾多糖（下文簡稱巢脾多糖）是蜜蜂巢脾中的主要功效成分，有著重要的開發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用空間，而目前對(duì)于蜂巢多糖的生物活性及開發(fā)應(yīng)用仍處于空白。本試驗(yàn)對(duì)初步純化后的巢脾多糖進(jìn)行理化性質(zhì)、急性毒性及對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用進(jìn)行分析，以期為蜜蜂巢脾多糖的生物活性及開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西方蜜蜂老巢脾（使用三年以上）。

氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、咔唑、溴化鉀、乙腈、甲醇、磷酸二氫鈉均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡啉酮（PMP）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，購自上海源葉生物科技有限公司。

綿羊紅細(xì)胞，南京森貝伽生物科技公司；小鼠免疫球蛋白IgG試劑盒，上海遠(yuǎn)幕生物科技公司；豚鼠血清（補(bǔ)體）上海遠(yuǎn)幕生物科技公司。

丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物制藥研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)T6，北京普析通用儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度TU-1901，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜1260，德國安捷倫公司；顯微紅外光譜儀670，美國Varian公司；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，共100只，6～8周齡，體重 18～22 g，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0004。使用小鼠全價(jià)顆粒飼料飼喂，飲用無菌水，環(huán)境安靜，室溫維持在20 ℃左右，通風(fēng)良好。

1.4 方法

1.4.1 提取蜜蜂巢脾多糖

粉碎的蜜蜂巢脾→按1:15比例加入蒸餾水→50 ℃水浴鍋水浴90 min→120目紗布過濾→重復(fù)三次→濃縮至→冷卻離心→1:4無水乙醇→4 ℃靜置過夜→取沉淀離心→蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白→濾去離子等小分子雜質(zhì)→蜜蜂巢脾多糖

1.4.2 多糖基本理化性質(zhì)的測(cè)定

1.4.2.1 基本組成測(cè)定

分別采用費(fèi)林試劑反應(yīng)及硫酸-苯酚法測(cè)定蜜蜂巢脾多糖中還原糖及總糖含量；利用三氯化鐵反應(yīng)及碘-碘化鉀反應(yīng)分別檢測(cè)多羥基酚類物質(zhì)及淀粉；考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量；硫酸-咔唑法檢測(cè)糖醛酸含量；pH計(jì)在室溫下測(cè)其pH值；不同極性溶液檢測(cè)其溶解性。

液相色譜條件[13]，色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸二氫鉀（pH 6.7）緩沖液-乙腈（0～18 min體積比為82:18，18～40 min體積比為83:17）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長：250 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。檢測(cè)器：DAD。

1.4.2.2 光譜分析

采用紫外光譜和紅外光譜判斷蜜蜂巢脾的多糖結(jié)構(gòu)。巢脾多糖樣品（0.05 mg/mL）置于紫外可見分光光度計(jì)中190 nm～380 nm波長處進(jìn)行掃描。巢脾多糖（充分干燥粉末）少許，加入少許溴化鉀晶體，在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨至極細(xì)，用壓片機(jī)壓制成透明薄片，經(jīng)顯微紅外光譜儀 400～4000 cm-1中紅外區(qū)掃描。

1.4.3 小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)[14]

1.4.3.1 霍恩氏法

按照GB 15193.3-2014進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。采用霍恩氏法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取SPF級(jí)KM小鼠12只，分為三組，每組4只，雌雄各半。試驗(yàn)用巢脾多糖低劑量組為100 mg/kg，中劑量組1000 mg/kg，高劑量組10000 mg/kg。實(shí)驗(yàn)組給藥設(shè)為24 h內(nèi)2～4次灌胃一次，灌胃量為20 mL/kg，實(shí)驗(yàn)過程中禁食不禁水5 h后灌胃，連續(xù)觀察24 h動(dòng)物的活動(dòng)狀態(tài)，呼吸，采食和分泌物。實(shí)驗(yàn)中若出現(xiàn)小鼠死亡，則按照動(dòng)物死亡的情況進(jìn)行霍恩氏法實(shí)驗(yàn)測(cè)定LD50，若無死亡則采用限量法繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3.2 限量法

SPF級(jí)KM小鼠，按性別分別稱體重，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組十只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水6 h。以巢脾多糖濃度10000 mg/kg，按照20 mL/kg的給藥量，24 h內(nèi)灌胃給藥。對(duì)照組采取同樣方法給予相同劑量的蒸餾水。每隔2 d測(cè)定小鼠體重，連續(xù)觀察14 d，記錄給藥后動(dòng)物活動(dòng)、飲食情況、精神狀態(tài)、不良反應(yīng)情況、動(dòng)物死亡數(shù)和死亡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束室，眼眶取血檢查血液常規(guī)指標(biāo)，尸檢動(dòng)物觀察各臟器有無異常。

1.4.4 動(dòng)物的分組與處理

SPF級(jí)KM小鼠70只，雌雄各半，將小鼠隨機(jī)分組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組及巢脾多糖高劑量組（200 mg/kg）、中劑量組（100 mg/kg）、中低劑量組（50 mg/kg）以及低劑量組（25 mg/kg）。除空白對(duì)照組外，各組小鼠第1、2、3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，建立免疫抑制小鼠模型。給免疫抑制的小鼠連續(xù)7 d灌胃巢脾多糖，陽性對(duì)照組灌胃鹽酸左旋咪唑(40 mg/kg)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3 d免疫動(dòng)物，每只腹腔注射2%的綿羊紅細(xì)胞0.2 mL，3 d后用眼眶取血法采血，放入4 ℃冰箱中保存，隔天取上層血清備用。

1.4.5 血清溶血素與免疫球蛋白IgG檢測(cè)

將小鼠血清 1:100稀釋于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)各100 μL，與加入5%的綿羊紅細(xì)胞50 μL和10%補(bǔ)體50 μL混勻，置于37 ℃溫水育30 min后，冰水終止反應(yīng)，以不加補(bǔ)體的空白管作對(duì)照，取上清液 540 nm測(cè)OD值（A540），數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)[15]。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中免疫球蛋白IgG。

1.4.6 血清抗氧化能力檢測(cè)

按照試劑盒方法測(cè)定血清中 MDA、T-SOD及CAT。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用spss 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜜蜂巢脾多糖理化性質(zhì)鑒定

2.1.1 蜜蜂巢脾多糖基本組成

圖1 巢脾多糖水解樣品-PMP衍生化產(chǎn)物的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectrum of PMP derivative products of comb polysaccharide

經(jīng)計(jì)算巢脾多糖中總糖含量為75.77%，蛋白質(zhì)的含量為13.82%，糖醛酸的含量為0.19%，還原糖的含量為 4.20%，不含淀粉及多酚類物質(zhì)。該多糖的 pH值為7.06，呈中性?？扇苡谒?、稀酸及稀堿，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶液。

HPLC分析結(jié)果如圖1所示，巢脾多糖中含有甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，其摩爾比為：0.08:0.09:0.11:0.05:0.03:0.08:1.00:0.84:0.11:3.04。其中阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖含量最高，半乳糖醛酸含量最低（表1）。

表1 巢脾多糖的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of comb polysaccharide

2.1.2 光譜分析

圖2 巢脾多糖的紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of comb polysaccharide

圖3 巢脾多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of comb polysaccharide

紫外光譜掃描結(jié)果見圖2：在波長380 nm～190 nm中，未出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，吸光度值隨著波長的縮短而增大，直至190 nm處出現(xiàn)最大吸收值。

紅外光譜是一種有效研究分子官能團(tuán)特征的手段。用來檢測(cè)化合物結(jié)構(gòu)的紅外光譜通常指波數(shù)在4000～400 cm-1之間的中紅外光譜。其具有高度的特征性，能夠測(cè)定分子內(nèi)部原子間的相對(duì)振動(dòng)和分子轉(zhuǎn)動(dòng)等信息，是研究聚合物結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，表征或鑒別不同化合物的常用手段之一。由于多糖的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，所以多糖的紅外光譜具有某些相同的特征吸收峰。通過對(duì)一些特征峰的分析，對(duì)于多糖結(jié)構(gòu)中是否含有這些殘基或大致判斷結(jié)構(gòu)類型還是有一定的幫助的。巢脾多糖的紅外光譜圖如圖3所示，結(jié)果顯示巢脾多糖具有典型的多糖特征吸收峰（3387.3 cm-1，2934.4 cm-1，1413.4 cm-1，772.3 cm-1）[16]。在 3387.3 cm-1處出現(xiàn)的寬峰為分子間和分子內(nèi)羥基（O-H）伸縮振動(dòng)特征峰[17]，2934.4 cm-1處吸峰收為糖鏈中飽和甲基或亞甲基（C-H）伸縮振動(dòng)峰[18]，1413.4 cm-1處吸收峰為N-H的變角振動(dòng)峰，772.3 cm-1處吸收峰為C-X伸縮振動(dòng)[19]。此外，1630.2 cm-1處吸峰收為C=O伸縮振動(dòng)峰，表明該多糖為糖蛋白綴合物[20,21]。而在1700 cm-1～1775 cm-1范圍內(nèi)無明顯吸收峰，表明樣品中不含梭基，即該多糖是一種中性糖[18]。1075.9 cm-1處吸收峰可能是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[19]，891.3 cm-1處有吸收說明該多糖存在β型吡喃糖苷[17]。

2.2 蜜蜂巢脾多糖急性毒性

2.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

24 h內(nèi)各預(yù)試驗(yàn)組小鼠均存活，小鼠表征無明顯變化，因此不需測(cè)定LD50，改為進(jìn)行限量法實(shí)驗(yàn)測(cè)定MTD值。

2.2.2 限量法實(shí)驗(yàn)

觀察期內(nèi)小鼠體重變化情況如表1所示。

表2 巢脾多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體重的影響Table 2 Effects of comb polysaccharide on the body weights of mice

由上圖得知兩組小鼠給藥前后體重變化，p>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且在喂食期間，小鼠活動(dòng)如常，被毛潔白光澤緊貼皮膚，眼紅明亮，肌肉緊張有力豐滿，尿便正常，無小鼠死亡。本實(shí)驗(yàn)按照限量法以劑量10000 mg/kg連續(xù)灌胃14 d，觀察期內(nèi)在此劑量下小鼠無任何不良反應(yīng)，認(rèn)為巢脾多糖的MTD值大于10000 mg/kg，此劑量相當(dāng)于500 g/人，據(jù)此按照GB 15193.5-2014可判定巢脾多糖為無毒物質(zhì)[14]。

2.3 蜂巢多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)影響

血清溶血素高低反映了被綿羊紅細(xì)胞免疫后的小鼠特異性體液免疫功能[15]。與正常對(duì)照組相比較，模型組中溶血素抗體含量顯著降低（p<0.01），表明造模成功；與模型組相比，陽性對(duì)照組和巢脾多糖各劑量組溶血素抗體含量顯著升高（p<0.01或 p<0.05），其中巢脾多糖灌胃劑量100 mg/kg時(shí)，溶血素抗體含量極顯著升高（p<0.01），其OD值達(dá)0.09。表明巢脾多糖能夠提高免疫抑制小鼠血清中溶血素抗體的含量，從而增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫功能。在體液免疫中，B細(xì)胞在抗原刺激下轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，合成免疫球蛋白，免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD五類。IgG是最典型的抗體，親和力高，分布廣，是機(jī)體重要的抗菌、抗病毒、抗毒素抗體[22]。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgG無顯著影響，巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

表3 巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素抗體及IgG生成的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of comb polysaccharide on the level of hemolysir and IgG in serum of immunosuppressive mice

表3 巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素抗體及IgG生成的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of comb polysaccharide on the level of hemolysir and IgG in serum of immunosuppressive mice

注：*p<0.05，**p<0.05。

組別 劑量/(mg/kg) OD值(平均值) IgG OD值空白對(duì)照組 - 0.12±0.01** 0.39±0.04**模型對(duì)照組 - 0.01±0.00 0.13±0.01陽性對(duì)照組 - 0.10±0.01* 0.34±0.04**低劑量組 25 0.03±0.01* 0.13±0.01中低劑量組 50 0.07±0.01* 0.13±0.01中劑量組 100 0.09±0.01** 0.13±0.01高劑量組 200 0.05±0.01* 0.12±0.01

2.4 巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中抗氧化能力的影響

機(jī)體的抗氧化能力與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，某些內(nèi)源性自由基反應(yīng)能通過自由基修飾免疫細(xì)胞膜上的受體、細(xì)胞分化和活性相關(guān)的微管系統(tǒng)，可逆地抑制免疫功能[23]。有研究表明，使用抗氧化劑可以提高免疫細(xì)胞微管系統(tǒng)的工作能力，提高機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫[24]。多糖對(duì)物理、化學(xué)及生物來源的多種活性氧具有清除作用，提高抗氧化酶活性及機(jī)體抗氧化能力。巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中抗氧化能力的影響結(jié)果如表4所示。與模型組相比，巢脾多糖各劑量組小鼠血清的SOD、CAT值明顯的提高、MDA值顯著降低(p<0.01或p<0.05)，中劑量組（100 mg/kg）小鼠血清抗氧化能力提高最為明顯，此劑量下小鼠血清SOD活性提高到125.07 U/mg prot，CAT活性提高到13.85 U/mL，MDA活性降低至4.89 nmol/mL，與模型組相比存在極顯著差異(p<0.01)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巢脾多糖能顯著提高免疫抑制小鼠血清中 SOD和CAT的活性，并降低MDA的含量，表明其能提高機(jī)體抗氧化能力，有效預(yù)防機(jī)體的脂質(zhì)過氧化，同時(shí)促進(jìn)了免疫抑制小鼠的免疫力恢復(fù)和提高。

表4 巢脾多糖對(duì)小鼠血清中SOD、CAT及MDA的影響(±s，n= 10)Table 4 Effects of comb polysaccharide on the level of SOD, CAT and MDA in serum of immunosuppressive mice (ˉx ± s, n = 10)

表4 巢脾多糖對(duì)小鼠血清中SOD、CAT及MDA的影響(±s，n= 10)Table 4 Effects of comb polysaccharide on the level of SOD, CAT and MDA in serum of immunosuppressive mice (ˉx ± s, n = 10)

注：*p<0.05，**p<0.05。

組別 劑量/(mg/kg) SOD含量/(U/mgprot) CAT含量/(U/mL) MDA含量/(nmol/mL)空白組 - 148.39±1.69** 17.01±1.57** 3.88±0.23**模型對(duì)照組 - 94.57±0.57 4.08±0.01 6.72±0.03陽性對(duì)照組 - 132.01±1.19** 15.81±1.36* 5.83±0.20*低劑量組 25 100.69±0.39* 4.67±0.15* 6.03±0.92中低劑量組 50 109.40±1.82* 5.87±0.26* 5.47±0.89*中劑量組 100 125.07±0.52** 13.85±0.66** 4.89±0.96**高劑量組 200 118.53±1.38** 7.83±0.40* 5.08±0.92**

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，巢脾總糖含量為75.77%，蛋白質(zhì)含量為13.82%，糖醛酸含量為0.19%，還原糖含量4.20%，該多糖由甘露糖、硫酸氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，是一種不含淀粉和多酚類物質(zhì)的多糖，是無毒物質(zhì)。同時(shí)初步證實(shí)蜜蜂巢脾多糖能顯著降低環(huán)磷酞胺對(duì)小鼠的免疫抑制作用，通過提高小鼠血清中SOD和CAT的活性，并降低MDA的含量來提高環(huán)磷酞胺所致的免疫損傷小鼠的抗氧化能力，劑量為100 mg/kg的巢脾多糖的作用最為顯著。本研究為巢脾多糖的開發(fā)利提供理論依據(jù)和參考，而巢脾多糖對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)的構(gòu)效關(guān)系及其活性作用機(jī)理有待于進(jìn)一步探索。

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