王宇鋒，楊春，陳超，鞏發(fā)海，孫書豪，李海

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004）（2.上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127）（3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏銀川 750004）

結(jié)直腸腫瘤（Colorectal neoplasms）是目前最常見的惡性腫瘤之一，每年大約有120萬人被診斷出患病率也在呈逐年上升趨勢，并且已和世界平均水平相當(dāng)，但治愈率仍然偏低[2]。在《2012年中國腫瘤登記有結(jié)直腸癌，而且此類疾病是多因素、多基因、多分子信號參與的復(fù)雜性過程[1]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)年報(bào)》中指出，前10名癌癥每10萬人發(fā)病數(shù)結(jié)直腸腫瘤占據(jù)第三位，僅次于肺癌、胃癌，并且在前 10名癌癥每10萬人死亡數(shù)結(jié)直腸腫瘤占據(jù)第五位[3]。目前來說，結(jié)直腸腫瘤的治療仍以西醫(yī)手術(shù)切除為主，并輔以放、化療，但不良反應(yīng)居多，對患者本身及預(yù)后造成十分大的影響。隨著中醫(yī)藥學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，中醫(yī)藥類對結(jié)直腸腫瘤的治療也凸顯出十分大的優(yōu)勢，尤其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡方面發(fā)揮著不錯(cuò)的療效[4]。

生姜是姜科多年生草本植物姜(Zingiber officinale Roscoe)的新鮮根莖，高40～100 cm，品種居多，別名又稱姜根、百辣云、勾裝指、因地辛、炎涼小子、鮮生姜和蜜炙姜等[5]。在中醫(yī)藥學(xué)中，姜的根莖(干姜)、栓皮(姜皮)、葉(姜葉)均可入藥，還具有發(fā)散、止嘔、止咳和驅(qū)寒等功效[6]。6-姜烯酚作為生姜中提取的主要活性成分，因其優(yōu)異的生物活性和極高的穩(wěn)定性越來越受到廣泛的關(guān)注。近年來有報(bào)道稱，6-姜烯酚是抗腫瘤藥，對多種腫瘤如前列腺癌[7]、胃癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]、皮膚癌[10]和乳腺癌[11]等都十分有效。

本研究擬通過檢測不同濃度 6-姜烯酚對 SW480干預(yù)表達(dá)作用及APC的表達(dá)變化，進(jìn)而探討6-姜烯酚在抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖中的相關(guān)可能機(jī)制，旨在為中醫(yī)藥聯(lián)合西醫(yī)手術(shù)及與放、化療的綜合治療提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

6-姜烯酚純度97%，購自于成都德瑞可生物科技有限公司；Leibovitz細(xì)胞培養(yǎng)液、Ausbian胎牛血清（FBS）原裝進(jìn)口于以色列；0.3%過氧化氫溶液購于中杉金橋；PAGE、SDS購于武漢博士德；雙抗（青霉素加鏈霉素）、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗，CCK8試劑盒、BCA蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自于南京凱基生物公司；脫脂牛奶、ECL、TEMED購于新西蘭生物公司；0.45 μm PVDF膜、抗APC抗體（兔抗人，1:1500稀釋）購于Thermo公司；PBS、甲醇、TBST、Tris-甘氨酸緩沖液購自于銀川偉博鑫化學(xué)試劑有限公司；30%聚丙烯酰胺購于 Bio-Rad Laboratories（Berkeley，CA）；細(xì)胞周期檢測試劑盒購于凱基生物公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺（Bio-Rad，型號ESCO AC2）；凝膠成像儀（Tanon 4200）；紫外可見酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad，型號：770）；XSE電子分析天平（常州天之平儀器，型號：DSH-50）；倒置熒光顯微鏡（美國Thermo，型號：Discover.V22）；細(xì)胞溫室培養(yǎng)箱（Bio-Rad，型號03793-6732）；液氮罐（河南天池儀器，型號：YDS-20）；全自動(dòng)高壓鍋（日本 SANYO，型號：MLS-3750）；高速冷凍離心機(jī)（Bio-Rad，型號 5435R）；臺式水平搖床（上海赫田科學(xué)儀器，型號HTS-10）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自于美國ATCC細(xì)胞庫，由北京中原公司提供，單層貼壁生長，集落形成率40%，裸鼠致瘤性100%。細(xì)胞培養(yǎng)條件：10%胎牛血清的 Leibovitz培養(yǎng)基、含 100 U/mL鏈霉素和 100 μg/mL青霉素，置于37 ℃、95% O2、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與常規(guī)培養(yǎng)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射 40 min以上，Leibovitz培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37 ℃預(yù)熱20 min，備用。二甲基亞砜（DMSO)在40 ℃冰箱中冷藏30 min，備用。從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37.5 ℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，然后將細(xì)胞懸液移入15 mL離心管，緩慢加入4 mL培養(yǎng)液，離心（1000 r/min，5 min）。用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并記錄復(fù)蘇日期。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，以1:3或1:4傳代，次日取對數(shù)生長期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 分組藥物干預(yù)

設(shè)立五組不同濃度藥物干預(yù)組：SW480-對照、SW480-6姜烯酚（5 μM）、SW480-6姜烯酚（10 μM）、SW480-6姜烯酚15 μM）、SW480-6姜烯酚（20 μM）組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察不同濃度 6-姜烯酚對不同分組SW480增殖的影響及細(xì)胞形態(tài)的不同變化。

1.2.3 CCK8法制作細(xì)胞抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線

在96孔板中配置100 μL的SW480細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。次日向96孔培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測物質(zhì)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48 h），每孔加入10 μL CCK8溶液。最后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，并用酶標(biāo)儀測定在490 nm處的吸光度。制作出一條以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 提取細(xì)胞蛋白，并測定蛋白含量

將上述不同藥物干預(yù)組細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，消化、收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞蛋白，并檢測蛋白濃度，按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液，于100 ℃水浴鍋中煮3～5 min，充分變性蛋白質(zhì)，備用。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5×105～1×106個(gè)/mL細(xì)胞，1000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液，加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，再次1000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清。重復(fù)以上步驟兩次，將細(xì)胞重懸于 200 μL Binding Buffer，加入10 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL Binding Buffer（總反應(yīng)體積500 μL）以及5 μL PI，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡周期

采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對照組，并收集各分組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，并2000 r/min，4 ℃離心5 min，棄去上清液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL細(xì)胞，取1 mL單細(xì)胞懸液，去除上清液，細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μL固定，過夜，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液，加入 100 μL RNaseA 37 ℃水浴 30 min，再加入 400 μL PI染色均勻，4 ℃避光保存30 min，最后上機(jī)在488 nm激發(fā)波長處記錄紅色熒光檢測。

1.2.7 Western-Blot檢測蛋白表達(dá)

根據(jù)所測蛋白樣品濃度，將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳80 V，2 h（濃縮膠5%、分離膠10%），然后電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)120 V、0.5 h，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，4%脫脂奶粉37 ℃封閉1.5 h，水平搖床搖勻，加入相應(yīng)的抗體 APC（1:1500稀釋）、β-actin（1:1000稀釋），4 ℃孵育過夜。應(yīng)用1% TBST洗膜，加入相應(yīng)的二抗（山羊抗兔）進(jìn)行免疫雜交反應(yīng)，室溫孵育2 h，再用1% TBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影，定影，在暗室凝膠成像儀下曝光成像并進(jìn)行凝膠圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用ANOVA方差分析，p≤0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 6-姜烯酚可明顯抑制SW480細(xì)胞增殖

不同分組 SW480加入 6-姜烯酚干預(yù)后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)變化（放大倍數(shù)：40×100 倍）。

結(jié)果顯示（圖1），與對照組相比，隨著6-姜烯酚濃度的升高，SW480-6姜烯酚組細(xì)胞數(shù)明顯減少，甚至在6-姜烯酚（20 μM）時(shí)，仍然可以明顯抑制細(xì)胞增殖。表明6-姜烯酚可以抑制SW480增殖，且隨濃度增加，抑制效果增加。

圖1 顯微鏡下不同濃度6-姜烯酚干預(yù)SW480 24 h后細(xì)胞的形態(tài)變化（±s，n=3）Fig.1 Morphological changes of SW480 induced by different concentrations of 6-shogoal for 24 h (±s, n=3)

2.2 CCK8法制作不同分組細(xì)胞的生長曲線

圖2 CCK8法檢測不同濃度6-姜烯酚對SW480增殖能力的調(diào)控（±s，n=3）Fig.2 Proliferation of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by CCK8 assay (24 h)

培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1～4 h，并用酶標(biāo)儀測定在490 nm處的吸光度。CCK8法檢測顯示細(xì)胞的光密度明顯下降與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。結(jié)果顯示（圖 2），與陰性對照組相比，SW480-6姜烯酚（5 μM）、SW480-6姜烯酚（10 μM）、SW480-6姜烯酚15 μM）、SW480-6姜烯酚（20 μM）組細(xì)胞數(shù)明顯減少，尤其是SW480-6姜烯酚（20 μM）細(xì)胞數(shù)家減少更為明顯（p<0.05）；隨著6-姜烯酚的濃度升高，可呈濃度依賴性地抑制細(xì)胞增殖（p<0.05）。

2.3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測6-姜烯酚誘導(dǎo)SW480凋亡

圖3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人SW480凋亡（±s，n=3）Fig.3 Apoptosis of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by Annexin V-FITC/pI flow cytometry (±s, n=3)

Nidhi等[12]研究 6-姜烯酚在人皮膚癌細(xì)胞 A431中的具體作用，發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚可以產(chǎn)生活性氧（ROS），從而降低線粒體膜電位水平，調(diào)節(jié)凋亡基因Bax/Bcl-2的比率，誘導(dǎo)皮膚癌細(xì)胞A431發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)還有專家Debrup[13]也證實(shí)了6-姜烯酚可以使處理過的Hela細(xì)胞活性減弱，并發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)誘導(dǎo)DNA構(gòu)象發(fā)生改變，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的各分組細(xì)胞（SW480）分別上流式細(xì)胞儀檢測，從熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖可以觀察（圖3a），其中右上象限、右下象限為死亡細(xì)胞數(shù)，圖 3b顯示的是不同分組的死亡細(xì)胞數(shù)。在 SW480各分組細(xì)胞中，隨著6-姜烯酚的濃度增加，死亡細(xì)胞數(shù)明顯不同程度增加（p<0.05）。從而證實(shí)6-姜烯酚可以誘導(dǎo)SW480發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

2.4 細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測 6-姜烯酚誘導(dǎo)SW480凋亡后細(xì)胞周期改變

本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的各分組細(xì)胞（SW480）分別上流式細(xì)胞儀檢測，從表1可以觀察不同濃度6-姜烯酚作用于SW480 24 h后，細(xì)胞增殖周期中各期細(xì)胞構(gòu)成發(fā)生明顯變化。其中 G0/G1期的細(xì)胞數(shù)由對照組的53.97%下降到37.42%和20.76%（p<0.05），而G2/M期的細(xì)胞數(shù)由對照組2.96%增加到33.81%和51.61%（p<0.05），提示SW480細(xì)胞被阻斷在G2/M期。

表1 細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人SW480凋亡細(xì)胞周期變化（±s，n=3）Table 1 Cell cycle changes of apoptosis of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by cell cycle detection kit(±s,n=3)

表1 細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人SW480凋亡細(xì)胞周期變化（±s，n=3）Table 1 Cell cycle changes of apoptosis of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by cell cycle detection kit(±s,n=3)

注：##p<0.01 vs 對照組, *p<0.05, **p<0.01 vs 對照組.

濃度/μM G0/G1/%S/% G2/M/%0 59.37 ± 0.88 37.67 ± 0.33 2.96 ± 0.33 5 50.46 ± 1.48* 38.57 ± 1.36* 10.97 ± 0.75*10 42.09 ± 0.87* 31.73 ± 1.29* 26.18 ± 1.21*15 37.42 ± 1.19* 28.77 ± 0.91* 33.81 ± 1.59*20 20.76 ± 1.07* 27.63 ± 0.69* 51.61 ± 1.37*

2.5 6-姜烯酚可促進(jìn)APC的表達(dá)

圖4 Western-blot檢測不同濃度6-姜烯酚對SW480中APC表達(dá)的影響（±s，n=3）Fig.4 Effects of 6-shogoal on the expression of APC in SW480 by Western-blot(±s, n=3)

楊平等[14]在研究藤黃酸抑制人結(jié)腸癌及與 APC表達(dá)關(guān)系中指出，藤黃酸可以在不同時(shí)間不同濃度下促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且與激活A(yù)PC的表達(dá)密切相關(guān)，同時(shí)也闡述了APC基因的表達(dá)可能是藤黃酸抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。同時(shí)，國內(nèi)學(xué)者劉楊等[15]也提出了散發(fā)性大腸腺瘤性息肉患者糞便中 APC基因突變表達(dá)有助于大腸腺瘤性息肉的篩查，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示如圖 4（a、b）所示，與對照組（1組）比較，Western-blot檢測不同濃度的6-姜烯酚對APC表達(dá)呈現(xiàn)不同程度升高（p<0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

3 結(jié)論

3.1 APC基因是一個(gè)很大的管家基因（housekeeping gene），也屬于一種腫瘤抑制基因，全長含有一個(gè)8538 bp開放式可讀框架，共15個(gè)外顯子，其中6個(gè)可變地表達(dá)。其中第15外顯子獨(dú)自含有6571個(gè)bp，組成77%的編碼區(qū)，是人類已知最大外顯子，它共編碼2843個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA分子為8.9 kb，在很多細(xì)胞和組織中均有表達(dá)。APC蛋白可結(jié)合微管，在細(xì)胞分裂和移動(dòng)中起作用[16]。APC還可通過調(diào)控周期素依賴周期素激酶復(fù)合物活性而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，通過誘導(dǎo)凋亡而介導(dǎo)其在結(jié)腸腺瘤發(fā)生中作用，故被譽(yù)為結(jié)腸上皮完整性的分子性“門衛(wèi)”（molecular “gatekeeper”）[17]。有報(bào)道稱[18]，APC基因的突變可改變APC蛋白與β連環(huán)蛋白及E鈣黏附蛋白之間的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)之間黏附作用以及接觸抑制信號傳遞的改變，引起細(xì)胞分裂與細(xì)胞死亡之間的平衡失調(diào)，以致生長失控，成為結(jié)直腸癌一個(gè)限速分子因素。

3.2 中藥及其提取物的生物活性成分具有毒副作用小、殘留少、藥理作用強(qiáng)、藥性溫和等特點(diǎn)，當(dāng)今，中藥在抗腫瘤方面的獨(dú)特作用，尤其是機(jī)制方面的研究更是越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[19]。中藥可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，主要是通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的相關(guān)凋亡通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖周期抑制來實(shí)現(xiàn)的[20]。有報(bào)道顯示，6S具有抗炎，鎮(zhèn)痛，解熱，抗氧化劑和抗癌的特性。在小細(xì)胞肺癌 A-549細(xì)胞系中，6S可以通過抑制AKT/mTOR通路誘發(fā)腫瘤細(xì)胞自我吞噬[21]。另外，Tan等[22]表明，6S可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ而抑制乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。Park等[23]報(bào)道，6S可通過靶向TBK1抑制TRIF依賴信號通路。在人體、動(dòng)物和腫瘤細(xì)胞系，6S的重要代謝路徑是硫醇尿酸路徑，6S最初通過谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與谷光甘肽（GSH）形成共軛化合物。其半胱氨酸共軛衍生物M14較6S具有更強(qiáng)的抑制結(jié)腸癌生長作用，在結(jié)腸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)M14較其母體毒性降低。

3.3 為進(jìn)一步了解 6-姜烯酚可能參與結(jié)直腸腫瘤凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)檢測了不同濃度的6-姜烯酚對人SW480的細(xì)胞增殖影響作用，發(fā)現(xiàn)在不同濃度6-姜烯酚的作用下，均可對 SW480造成明顯的抑制作用，而且隨著藥物濃度增加，SW480凋亡細(xì)胞數(shù)也不同程度的增加，表明了 6-姜烯酚對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。同時(shí)也證實(shí)了6-姜烯酚可不同程度地抑制SW480的DNA合成和有絲分裂，致使SW480細(xì)胞增殖周期阻斷在G2/M期，這種周期阻滯會與腫瘤細(xì)胞的增殖和生長停滯關(guān)系密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞自身不能修復(fù)或完全修復(fù)不了時(shí)，細(xì)胞就會生長停滯直至凋亡。

3.4 本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了6-姜烯酚抑制人SW480細(xì)胞增殖可能與激活A(yù)PC的表達(dá)有關(guān)，然而6-姜烯酚具體的抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞機(jī)制或APC直接（間接）與哪些通路有關(guān)尚未明確，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來探討證實(shí)6-姜烯酚的具體抗結(jié)直腸腫瘤作用機(jī)制。隨著6-姜烯酚及其藥理活性的不斷深入研究，進(jìn)一步明確6-姜烯酚誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤凋亡的機(jī)制，同樣可以成為篩選抗癌藥物的新靶點(diǎn)和新熱點(diǎn)，也可為今后臨床治療提供切實(shí)有效的依據(jù)。

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