段春慧 湯新明 張思新 胡丹丹 索 勛 劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)是包括弓形蟲、瘧原蟲、住肉孢子蟲等在內(nèi)的頂復(fù)門原蟲中的一大類胞內(nèi)寄生原蟲。不同蟲種的艾美耳球蟲感染多種畜禽，尤其感染雞的艾美耳球蟲對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失(李祥瑞, 2011)。長期以來，球蟲病的防治以藥物為主，耐藥性及藥物殘留問題逐漸顯現(xiàn)。雞球蟲活卵囊疫苗經(jīng)歷了強毒苗、弱毒苗的發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用，其中弱毒活卵囊疫苗雖具備高效、安全等優(yōu)點，但生產(chǎn)成本較高。因此，開發(fā)新型抗球蟲藥物及疫苗迫切需要尋找艾美耳球蟲的特異性藥物靶點或是抗原分子 (劉賢勇等, 2014)。

20世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類認(rèn)識生命本質(zhì)并主動改造生命的新時期開始。Berg等將SV40病毒DNA與噬菌體P22 DNA在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Jacksonetal., 1972)，使本來在真核生物中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成，打破了種屬界限。在剛地弓形蟲和惡性瘧原蟲成功實現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染(Goonewardeneetal., 1993; Soldatietal., 1993)，使頂復(fù)門原蟲的基因操作技術(shù)也從醞釀期進(jìn)入發(fā)展時期。頂復(fù)門不同原蟲轉(zhuǎn)基因研究取得的突破和進(jìn)展，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為研究頂復(fù)門原蟲入侵、代謝等相關(guān)基因功能、研制新型疫苗 (如活載體疫苗和DNA疫苗) 和篩選新的藥物靶基因等方面的有力工具。而艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)基因研究也緊跟步伐進(jìn)入探索階段。

隨著艾美耳球蟲基因組分析研究的向前推進(jìn)，其研究即將或已經(jīng)進(jìn)入后基因組時代。對艾美耳球蟲基因及其基因產(chǎn)物的功能研究是發(fā)現(xiàn)有效疫苗和抗球蟲藥物作用靶位的必要前提，而轉(zhuǎn)染技術(shù)將成為基因操作的有力工具。以往基因功能的研究局限于已知功能基因的比較和間接地推測，艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用使球蟲基因表達(dá)調(diào)控、藥物抗性研究以及疫苗的研究進(jìn)入嶄新的發(fā)展時期。本文將對轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲的研究工作進(jìn)行回顧和展望。

1 艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立與發(fā)展

1.1 艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的探索

自1993年，轉(zhuǎn)基因技術(shù)首次在弓形蟲成功報道以來，其他頂復(fù)門原蟲的轉(zhuǎn)染研究相繼展開。而艾美耳屬球蟲的轉(zhuǎn)基因技術(shù)起步較晚，至1998年，Kelleher等 (1998) 才首次使用報告基因β-半乳糖苷酶實現(xiàn)了柔嫩艾美耳球蟲的瞬時轉(zhuǎn)染，這也是對艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因操作的初步嘗試。但因艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染效率較低,其轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展受到一定程度的制約。郝力力等 (2007) 利用表達(dá)黃色、紅色熒光蛋白的質(zhì)粒實現(xiàn)了柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段蟲體內(nèi)的瞬時轉(zhuǎn)染，為艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因艾美耳球蟲代表性蟲株——柔嫩艾美耳球蟲盲腸寄生的特點，利用泄殖腔接種轉(zhuǎn)染后的子孢子成功實現(xiàn)了其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (Yanetal., 2009)，同樣的和緩艾美耳球蟲也利用此種策略取得成功 (Qinetal., 2014)。與此同時，一方面我們實驗室實現(xiàn)了巨型艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲的瞬時轉(zhuǎn)染 (Zouetal., 2009)；另一方面，我們也通過翅靜脈接種堆型艾美耳球蟲子孢及泄殖腔接種毒害艾美耳球蟲二代裂殖子成功實現(xiàn)了堆型、毒害艾美耳球蟲的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的過程中，球蟲研究者還對其他宿主寄生的艾美耳球蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)染嘗試。如寄生于大鼠的尼氏艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染后的子孢子經(jīng)口接種至胃酸中和的大鼠而成功轉(zhuǎn)染 (Kurthetal., 2009)。而兔球蟲中的斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲則通過外科手術(shù)將轉(zhuǎn)染后的子孢子直接接種于腸道而轉(zhuǎn)染成功 (Shietal., 2016; Taoetal., 2017；未發(fā)表數(shù)據(jù))。不同球蟲蟲種的成功轉(zhuǎn)染(圖1)大大推動了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在艾美耳球蟲中的發(fā)展與應(yīng)用。

1.2 艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)化與發(fā)展

因艾美耳屬球蟲轉(zhuǎn)染效率較低、體外培養(yǎng)困難及生活史復(fù)雜等眾多因素的限制使轉(zhuǎn)基因技術(shù)在艾美耳球蟲的發(fā)展明顯滯后于頂復(fù)門其他原蟲。因此優(yōu)化艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染顯得尤為重要，其中優(yōu)化轉(zhuǎn)染載體和轉(zhuǎn)染方法是優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)的兩大核心部分。

1.2.1球蟲轉(zhuǎn)染流程: 優(yōu)化雞球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)，首先要了解雞球蟲轉(zhuǎn)染流程。自成功實現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲瞬時轉(zhuǎn)染以來，艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)取得一定程度的發(fā)展。根據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因球蟲的研究結(jié)果及經(jīng)驗，特將其轉(zhuǎn)染流程簡單總結(jié)如下：(1) 構(gòu)建含有目的基因調(diào)控序列的報告基因載體。一般而言用于頂復(fù)門原蟲轉(zhuǎn)染的載體是由啟動子、3’轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列以及兩者之間的一個完整開放閱讀框組成。不同基因的啟動子可以共用同一個3’轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列。例如柔嫩艾美耳球蟲MIC1和組蛋白4啟動子可共用Actin3’轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列 (Yanetal., 2009; Yinetal., 2011)。(2) 使用AMAXA Nucleofector系統(tǒng)中U-033程序或電穿孔方法轉(zhuǎn)染經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化后的質(zhì)粒及純化后的子孢子 (裂殖子) 并使用DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。研究證實線性化質(zhì)粒比環(huán)形質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高，因此轉(zhuǎn)染前要對質(zhì)粒進(jìn)行線性化。(3) 轉(zhuǎn)染后的子孢子 (裂殖子) 接種MDBK細(xì)胞于24 h后觀察轉(zhuǎn)染成功與否或者接種至雞體內(nèi) (泄殖腔、靜脈接種或手術(shù)) 經(jīng)3～5代流式聯(lián)合藥物傳代篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體。但這種轉(zhuǎn)基因群體的遺傳性狀仍然是不一致的，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因整合位點的隨機性。(4) 轉(zhuǎn)基因球蟲鑒定。經(jīng)篩選后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體利用多種監(jiān)測手段如免疫印跡 (Western Blot) 和間接免疫熒光 (Indirect Immunofluorescent Assay) 等鑒定外源蛋白的表達(dá)，同時用染色體步移 (Genome Walking) 或質(zhì)粒拯救 (Plasmid Rescue) 或DNA測序等來確定轉(zhuǎn)基因在球蟲染色體上的整合位點。(5) 利用單孢子囊分離甚是單子孢子分離技術(shù)獲得遺傳一致的轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲系。經(jīng)流式和藥物聯(lián)合篩選獲得的轉(zhuǎn)基因群體，其遺傳性狀仍不穩(wěn)定，因此需要進(jìn)行單孢子囊 (子孢子) 分離。我們實驗室通過單孢子囊分離技術(shù)獲得了一株遺傳性能一致的轉(zhuǎn)基因球蟲系——表達(dá)黃色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因球蟲株EtM2e (Liuetal., 2013)。

圖1 已經(jīng)實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的艾美耳球蟲種類Fig.1 The Eimeria species been successfully transfected

1.2.2轉(zhuǎn)染載體的優(yōu)化：載體是轉(zhuǎn)染技術(shù)的核心部分之一，優(yōu)化轉(zhuǎn)染載體是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。頂復(fù)門原蟲轉(zhuǎn)染最初多用環(huán)形粒。Kelleher等 (1998) 首次報道的柔嫩艾美耳球蟲的瞬時轉(zhuǎn)染使用的也是環(huán)形質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率僅為10-4～10-6。而經(jīng)過不斷探索，Black等 (1995) 將限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)染應(yīng)用于弓形蟲中并實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率提高了10～100倍，為提高艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染效率提供了借鑒。之后，研究者借鑒限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)染，探究了分別表達(dá)黃色熒光蛋白和藥物篩選基因的質(zhì)粒在球蟲中共用的可行性，流式分選與藥物篩選的結(jié)合顯著提高了球蟲的轉(zhuǎn)染效率，自此轉(zhuǎn)染效率提高近200倍 (Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)，該項技術(shù)的突破，極大地促進(jìn)了各部調(diào)控元件的優(yōu)化。此外，利用雙框表達(dá)載體實現(xiàn)外源基因在柔嫩艾美耳球蟲中的表達(dá) (Yinetal., 2011)，為利用雙框表達(dá)策略啟動不同外源抗原提供有益探索。國外研究者將藥篩基因 (TgDHFR-TS)與熒光蛋白融合表達(dá) (Hanigetal., 2012)，簡化轉(zhuǎn)染載體，提高轉(zhuǎn)染效率，極大地加快了篩選速度。

此外，研究表明piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也可以應(yīng)用于艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)基因研究，被整合至基因組的DNA分子的特異性位點為TTAA，符合其轉(zhuǎn)座特征，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的球蟲群體 (Suetal., 2012)，因此piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將有可能進(jìn)一步提高球蟲轉(zhuǎn)染效率，那么piggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在艾美耳球蟲的應(yīng)用不失為一種優(yōu)化方向。近來將豬捷申病毒的自剪切序列P2A引入球蟲表達(dá)載體后實現(xiàn)了同一表達(dá)框中兩個外源基因的非融合表達(dá) (Tangetal., 2016)，為表達(dá)多基因的轉(zhuǎn)基因球蟲奠定良好基礎(chǔ)，同時利用SAG13強啟動子顯著提高了其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，這也是提升轉(zhuǎn)基因球蟲表達(dá)異源抗原水平的有益嘗試。因此，不斷優(yōu)化的載體促進(jìn)了轉(zhuǎn)染效率的提升，從而促進(jìn)艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)穩(wěn)步發(fā)展。

1.2.3轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)化：目前的轉(zhuǎn)染方法主要有電穿孔轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射、基因槍等方法，而在頂復(fù)門原蟲研究中應(yīng)用較廣泛的是電穿孔轉(zhuǎn)染。最初的柔嫩艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染主要應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染方法，然而較低的轉(zhuǎn)染效率促使人們?nèi)ヌ剿餍碌霓D(zhuǎn)染方法來改變這一現(xiàn)狀?；陔姶┛邹D(zhuǎn)染的AMAXA Nucleofector轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的出現(xiàn)，顯著提高了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并且可適用于艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染。AMAXA Nucleofector是綜合應(yīng)用傳統(tǒng)的電穿孔技術(shù)及細(xì)胞特異性細(xì)胞核轉(zhuǎn)染液，通過調(diào)整優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)，直接把外源基因?qū)朐?xì)胞及細(xì)胞系的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的一項技術(shù)。在轉(zhuǎn)基因球蟲研究中，國外球蟲研究者Clark等 (2008) 首先利用AMAXA Nucleofector轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的U-033程序結(jié)合限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染顯著提高球蟲的轉(zhuǎn)染效率, AMAXA Nucleofector系統(tǒng)是優(yōu)化球蟲轉(zhuǎn)染方法的重要一步。

1.2.4艾美耳球蟲卵囊轉(zhuǎn)染嘗試：由于子孢子轉(zhuǎn)染操作較為費時費力，多個研究團隊也進(jìn)行了其他轉(zhuǎn)染方法的嘗試?；谧渔咦愚D(zhuǎn)染受到眾多限制，研究者一直在探索卵囊轉(zhuǎn)染方法以簡化繁瑣的球蟲轉(zhuǎn)染程序。利用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)染未孢子化卵囊后可以檢測到外源基因的插入，這是優(yōu)化球蟲轉(zhuǎn)染程序的一次大膽嘗試 (Lietal., 2012)。利用病毒載體介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)轉(zhuǎn)染柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊 (Wangetal., 2017; Xinetal., 2018) 也是繼基因槍技術(shù)之后卵囊轉(zhuǎn)染的又一有益嘗試。盡管現(xiàn)階段的轉(zhuǎn)染方法大幅度提升了轉(zhuǎn)染效率，但也受到眾多限制。因此我們?nèi)皂毑粩鄧L試與探索新的方法使球蟲轉(zhuǎn)染實現(xiàn)質(zhì)的飛躍。

1.3 球蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨的問題與挑戰(zhàn)

盡管當(dāng)前艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染已經(jīng)取得了突破性的研究進(jìn)展，但在基因操作技術(shù)和轉(zhuǎn)基因球蟲的應(yīng)用方面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。低轉(zhuǎn)染效率一直是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究艾美耳球蟲的主要屏障，這就要求我們提高轉(zhuǎn)染效率并簡化轉(zhuǎn)染步驟。首先轉(zhuǎn)染效率問題是制約基因操作技術(shù)在球蟲應(yīng)用的重要一環(huán)。盡管限制性內(nèi)切酶及球蟲內(nèi)源性強啟動子的應(yīng)用使球蟲的轉(zhuǎn)染效率從最開始的10-4～10-6提升了百倍，但其轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于弓形蟲等頂復(fù)門其他原蟲，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)特定基因的過表達(dá)、敲除、插入及突變略顯艱難，嚴(yán)重制約球蟲基因操作技術(shù)的發(fā)展。其次因艾美耳屬球蟲體外培養(yǎng)較為困難，必須借助動物完成轉(zhuǎn)染后球蟲的生活史。眾多的不可控因素，使球蟲轉(zhuǎn)染研究的步伐被迫放緩。再次，對子孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作繁瑣、費時費力且使用范圍具有一定的局限性，因此尋求更為便捷的轉(zhuǎn)染方法是優(yōu)化球蟲轉(zhuǎn)染的必要環(huán)節(jié)。目前，直接轉(zhuǎn)染卵囊或者孢子囊就是最值得期待的技術(shù)突破。并且已利用基因槍、病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行卵囊轉(zhuǎn)染的探索 (Lietal., 2012; Wangetal., 2017)。此外，球蟲作為疫苗載體的研究尚處于初級階段，轉(zhuǎn)基因球蟲表達(dá)外源蛋白的量一直是大家關(guān)注并不斷探索的節(jié)點。因此，在優(yōu)化艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)的道路上仍需要不斷探索與嘗試，以推進(jìn)遺傳操作技術(shù)在球蟲的發(fā)展。

2 艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為疫苗活載體

自1983年誕生第一個轉(zhuǎn)基因生物煙草以來，大大推動了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，尤其是在疫苗開發(fā)領(lǐng)域顯示了越來越光明的前景。近年來隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，獸用疫苗的研制和開發(fā)獲得了快速發(fā)展。其中基因工程活載體疫苗因其可同時啟動機體體液和細(xì)胞免疫并且可以構(gòu)成多價乃至多聯(lián)疫苗，使之成為近幾年來新型疫苗研制最為活躍，也是最有希望的發(fā)展方向?；谇蛳x轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，將轉(zhuǎn)基因球蟲開發(fā)作為活載體將成為研究活載體疫苗的有力工具。

在研究轉(zhuǎn)基因球蟲針對表達(dá)異源蛋白甚至是球蟲自身蛋白激發(fā)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答研究方面，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了逐步探索。有研究發(fā)現(xiàn)，與黃色熒光蛋白表達(dá)定位于胞漿的轉(zhuǎn)基因球蟲相比，黃色熒光蛋白表達(dá)并分泌至帶蟲空泡的轉(zhuǎn)基因球蟲能激發(fā)更好的黏膜IgA應(yīng)答 (Huangetal., 2011)，為轉(zhuǎn)基因球蟲的免疫應(yīng)答研究提供了很好的技術(shù)平臺。國外研究者發(fā)現(xiàn)，表達(dá)空腸彎曲桿菌保護性抗原CjaA的柔嫩艾美耳球蟲對免疫雞群能提供部分抵抗空腸彎曲桿菌感染的免疫保護 (Clarketal., 2012)，為艾美耳球蟲作為禽病疫苗載體提供了直接證據(jù)。此外有研究顯示，柔嫩艾美耳球蟲表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2抗原和傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白抗原可被宿主的免疫系統(tǒng)所識別并使雞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 (Marugan-Hernandezetal., 2016)。同時因頂復(fù)門原蟲基因的保守性，表達(dá)頂復(fù)門其他原蟲的蛋白并不存在密碼子偏好性，如柔嫩艾美耳球蟲表達(dá)弓形蟲SAG1蛋白 (Tangetal., 2016)，能夠激發(fā)抗弓形蟲感染的保護性免疫應(yīng)答，推動了將球蟲改造為禽類其他重大疫病病原的疫苗載體的發(fā)展。

在表達(dá)其他艾美耳球蟲抗原基因的構(gòu)建和測試中發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲表達(dá)巨型艾美耳球蟲的profilin、AMA1及IMP1基因分別刺激機體產(chǎn)生抗巨型艾美耳球蟲的免疫保護 (Tangetal., 2018a; 2018b)，從而為減少疫苗組分、降低成本奠定基礎(chǔ)。而基于不同艾美耳球蟲蟲種免疫原性的差異、通過導(dǎo)入外源佐劑分子提高艾美耳球蟲免疫原性的研究結(jié)果證實，雞的細(xì)胞因子 (如IL-2) 和IgY Fc片段可分別作為分子佐劑顯著增強球蟲的免疫原性 (Lietal., 2015; Qinetal., 2016)。

2.2 利用轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究

基因調(diào)控是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的中心課題之一。生物體內(nèi)的基因在轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯以及轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子之前的所有加工過程都是受著精細(xì)機制的調(diào)控。要了解艾美耳屬球蟲的生長發(fā)育規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能，就必須搞清楚基因表達(dá)調(diào)控的時間和空間概念。雞球蟲瞬時轉(zhuǎn)染的實現(xiàn)，加速了基因表達(dá)調(diào)控的研究。利用表達(dá)報告基因的時間和強度，可以篩選到階段特異性表達(dá)的優(yōu)秀啟動子和持續(xù)性表達(dá)的強啟動子。例如柔嫩艾美耳球蟲表面抗原蛋白SAG13的調(diào)控序列能顯著提高其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，但其在柔嫩艾美耳球蟲未孢子化階段不能啟動熒光蛋白的表達(dá) (Tangetal., 2016)，而在兔黃艾美耳球蟲和鐮型艾美耳球蟲所有生活史階段均啟動熒光蛋白的表達(dá)。此外，柔嫩艾美耳球蟲的MIC-1也屬于在未孢子化階段不能驅(qū)動熒光蛋白表達(dá)的階段性啟動子 (Yinetal., 2011)。Actin和組蛋白4基因啟動子能驅(qū)動熒光蛋白在球蟲孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖階段持續(xù)性地高表達(dá) (Shietal., 2008; Yanetal., 2009)。因此,通過轉(zhuǎn)染技術(shù)可以鑒定和篩選種特異性或種間保守性啟動和終止調(diào)控序列，使其成為研究基因表達(dá)調(diào)控的有力工具。

2.3 利用轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲進(jìn)行功能基因研究

以往基因功能的研究局限于已知功能基因的比較和間接地推測，近年來轉(zhuǎn)基因技術(shù)在球蟲的應(yīng)用加速了基因功能研究的準(zhǔn)確化，使雞球蟲基因的研究現(xiàn)狀大為改觀。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以直觀準(zhǔn)確的了解相關(guān)功能蛋白在蟲體細(xì)胞內(nèi)的定位與分布。柔嫩艾美耳球蟲組蛋白4基因的核定位序列能將黃色熒光蛋白定位到球蟲子孢子、裂殖子、未孢子化卵囊等階段蟲體的核中 (Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)。而弓形蟲致密顆粒蛋白GRA8和瘧原蟲RIFIN蛋白的信號肽序列能夠?qū)ⅫS色熒光蛋白分泌到帶蟲空泡內(nèi) (Shietal., 2009)。此外，柔嫩艾美耳球蟲的膜錨定序列GPI及MCP2序列分別能夠?qū)⑼庠吹鞍锥ㄎ坏阶渔咦幽ど虾臀⒕€體上 (Marugan-Hernandezetal., 2017a; Marugan-Hernandezetal., 2017b)。另一方面，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以從分子水平上弄清控制入侵、運動、代謝、致病性和宿主特異性等生物學(xué)功能的重要基因。而基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù)在球蟲的不斷探索將能夠?qū)τ诨蚬δ苎芯康耐茰y進(jìn)行有效驗證 (Barrangouetal., 2014)。隨著艾美耳球蟲全基因組測序的推進(jìn)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)將成為研究艾美耳球蟲基因功能的重要工具。

2.4 利用轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲進(jìn)行耐藥性和新藥物靶基因研究

長期以來，球蟲病的防治以藥物為主，耐藥性及藥物殘留問題日益突出。因此，揭示耐藥性分子機理顯得尤為重要。瘧原蟲和弓形蟲的DHFR-TS 中2～3個位點的突變導(dǎo)致乙胺嘧啶抗性 (Wuetal., 1996)，因而可以用來篩選轉(zhuǎn)基因蟲系。同樣的，研究者發(fā)現(xiàn)弓形蟲的DHFR-TS誘發(fā)2個點突變后的耐藥基因同樣適用于艾美耳球蟲 (Clarketal., 2008)。基于測序篩選出的耐藥基因借助轉(zhuǎn)染技術(shù)、利用基因突變、敲除等策略進(jìn)行驗證，從而揭示耐藥分子機理及篩選新的藥物靶點。此外，頂復(fù)門原蟲代謝途徑與宿主相比差別較大，可選取調(diào)控代謝等的基因或分子作為新的藥物靶點候選分子。因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)將成為揭示耐藥性分子機理及篩選新的藥物靶點的有效手段。

3 總結(jié)與展望

艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因平臺經(jīng)歷十多年的探索式發(fā)展，為新型球蟲病疫苗研發(fā)描繪了光明前景。同時，艾美耳球蟲基因組計劃的不斷深入研究，極大地推動了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在艾美耳球蟲的應(yīng)用。此外，大量未知基因的功能研究及藥物靶基因和保護性抗原基因的篩選為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了更為廣闊的應(yīng)用平臺。然而艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染效率及外源蛋白的表達(dá)量成為制約其遺傳操作的瓶頸。如何提高轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)基因球蟲表達(dá)外源蛋白的量也是我們亟待解決的問題?；贑RISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)在球蟲的探索研究將有望將轉(zhuǎn)基因球蟲的發(fā)展推向新的高度。雞球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)作為強大的研究工具，將有效推動轉(zhuǎn)基因球蟲作為疫苗活載體的研究。