于金玲， 沈衛(wèi)達(dá)， 高蓓敏， 趙海燕， 曹小曼

(上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院乳腺科，上海 200051)

三陰性乳腺癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目前臨床缺乏有效的治療靶點(diǎn)[1]。MicroRNAs(miRNAs)是具有大約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過(guò)促進(jìn)靶基因mRNA的降解或抑制翻譯而調(diào)節(jié)靶基因的功能，在細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、代謝、凋亡、衰老和腫瘤的發(fā)生等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]。多種miRNAs與三陰性乳腺癌(three-negative breast cancer, TNBC)的預(yù)后相關(guān)，可以作為轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-182在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)。miR-182高表達(dá)是三陰性乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素之一，與不良預(yù)后相關(guān)[5-6]，是潛在的三陰性乳腺癌治療靶點(diǎn)。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXF2低表達(dá)可導(dǎo)致乳腺腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良，但目前尚未見(jiàn)miR-182與FOXF2的關(guān)聯(lián)性研究。本研究通過(guò)生物學(xué)信息軟件Targetscan(http:∥www.targetscan.org/vert_61/)發(fā)現(xiàn)miR-182在FOXF2的3′-UTR端688～695片段和485～491片段有潛在結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步明確miR-182的表達(dá)水平與乳腺癌增殖、侵襲的關(guān)系，本研究探討miR-182/FOXF2信號(hào)通路在三陰性乳腺癌侵襲及血管生成的意義。

1 材料與方法

1.1 倫理申明

由于本實(shí)驗(yàn)涉及人源細(xì)胞的采集，因此所有涉及倫理問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)操作均報(bào)備了上海長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)，并已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))在37℃含10% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用DMEM培養(yǎng)基加10%體積的胎牛血清培養(yǎng)；質(zhì)粒及miRNA mimic使用LipofectamineTM2000試劑(Gibco公司)轉(zhuǎn)染。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 使用在線預(yù)測(cè)工具miRWalk對(duì)可靶向結(jié)合FOXF2基因3′-UTR的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)has-miR-182靶點(diǎn)預(yù)測(cè)信息，將FOXF2基因上的2個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別構(gòu)入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-3′UTR中，將構(gòu)建成功的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性是否降低。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建及Luciferase測(cè)試報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞接種于48孔板。細(xì)胞鋪板24h后，使用Poly-Fecter轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔用量如下： has-miR-182 mimics 100ng，Luc-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒100ng，內(nèi)參Renilla 5ng。以陰性參照siRNA(NC)100ng加Luc-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒100ng，內(nèi)參Renilla 5ng為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。6h后換液；轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞，測(cè)試luciferase活性。

1.2.4 miRNA靶點(diǎn)突變測(cè)試報(bào)告及內(nèi)源基因表達(dá)量檢測(cè) 根據(jù)前期miR-182對(duì)目的基因FOXF2 3′UTR的測(cè)試結(jié)果，將包含has-miR-182靶點(diǎn)的FOXF2-U2靶點(diǎn)序列突變，并將構(gòu)建成功的熒光素酶報(bào)告基因突變質(zhì)粒與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性是否恢復(fù)，進(jìn)一步明確miR-182的結(jié)合位點(diǎn)。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182，對(duì)照組轉(zhuǎn)染si-NC。24～48h后提取RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)FOXF2 mRNA表達(dá)量變化。

1.3 細(xì)胞的CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

將MDA-MB-231細(xì)胞和MCF7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3000細(xì)胞/孔。18h后轉(zhuǎn)染siRNA，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染AntagomiR-182，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182分別作為實(shí)驗(yàn)組。以不干擾任何基因的相應(yīng)的MicroRNA為對(duì)照組，每組重復(fù)3次，LipofectamineTMRNAiMAX的用量為0.25μL/孔，RNA的用量為5pmol/孔，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72h后吸去培養(yǎng)基，每孔換成含有10%的CCK-8的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1h。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)細(xì)胞活力值。

1.4 細(xì)胞的侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

將MDA-MB-231細(xì)胞和MCF7細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。18h后轉(zhuǎn)染siRNA，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染AntagomiR-182，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182，分別作為實(shí)驗(yàn)組。以不干擾任何基因的MicroRNA為對(duì)照組，每組重復(fù)3次，LipofectamineTMRNAiMAX的用量為0.25μL/孔，RNA的用量為5pmol/孔，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后，將基質(zhì)膠和DMEM培養(yǎng)基以1∶3的比例混合后每孔上室加入20μL，放入37℃培養(yǎng)箱靜置30min，使膠凝結(jié)。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞消化打散，取100000個(gè)細(xì)胞，加入Transwell小室上層，總體積為100μL，不含血清，每組用3個(gè)小室。小室下層中加入600μL含有10%血清的培養(yǎng)基。48h后將Transwell小室用4%多聚甲醛固定，然后將上層膜的細(xì)胞輕輕擦除，下層膜的細(xì)胞用DAPI染色。將染色后的下層膜的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下拍照，每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野，20×物鏡觀察。對(duì)每張照片中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 qRT-PCR

使用TRIzol抽取總RNA，并采用RNA-PCR試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Sybr GreenMaster Mix(TaKaRa公司)行qRT-PCR，見(jiàn)表1。以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化參照，使用ΔΔCt法計(jì)算不同基因的相對(duì)表達(dá)狀況。

表1 qRT-PCR中采用的引物序列

1.6 ELISA實(shí)驗(yàn)

將MCF-7、HUVEC細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-182，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染si-NC。轉(zhuǎn)染使用Lipofectami-neTMRNAiMAX Reagent試劑盒。轉(zhuǎn)染48h后，收集上清液，依ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)VEGF表達(dá)量變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 熒光素酶基因報(bào)告及內(nèi)源基因表達(dá)結(jié)果

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示FOXF2基因的3′UTR序列端的2個(gè)靶點(diǎn)的目的片段分別為485～491(U1)、688～695(U2)，見(jiàn)表2。MiRNA靶點(diǎn)突變測(cè)試報(bào)告測(cè)試MCF-7，發(fā)現(xiàn)FOXF2-U1熒光素酶活性降低不顯著(P=0.145)，而FOXF2-U2熒光素酶活性降低較為明顯(P=0.001)。即FOXF2基因的688～695靶點(diǎn)為has-miR-182的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-182后MCF-7中FOXF2表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。

表2 has-miR-182與FOXF2的結(jié)合靶點(diǎn)表

2.2 miR-182對(duì)細(xì)胞增殖影響

細(xì)胞CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染AntagomiR-182后使其表達(dá)抑制，細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01)，與預(yù)期結(jié)果相符；低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-182使其過(guò)表達(dá)，細(xì)胞增殖能力提高(P<0.01)，與預(yù)期結(jié)果相符，見(jiàn)圖1。

圖1 CCK-8中MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞系增殖率Fig.1 Proliferation rate of MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines with CCK-8與Si-NC組比較，*P<0.01

2.3 細(xì)胞的侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞膠穿(侵襲)和空穿(遷移)數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染了AntagomiR-182的MDA-MB-231細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量減少(P<0.05)；與對(duì)照組細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染了miR-182的MCF-7細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量增多，且較為明顯(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 Transwell實(shí)驗(yàn)?zāi)z穿與空穿細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.4 qRT-PCR檢測(cè)MCF-7和HUVEC細(xì)胞系中VEGF基因表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-182的MCF-7細(xì)胞系和HUVEC的VEGF基因表達(dá)情況如圖2。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞系和HUVEC的VEGF基因表達(dá)與miR-182的濃度無(wú)關(guān)(P>0.05)。

圖2 MCF-7和HUVEC細(xì)胞系中VEGF基因表達(dá)Fig.2 VEGF gene expression in MCF-7 and HUVEC cell linesA： VEGF基因在MCF-7細(xì)胞系中表達(dá)；B： VEGF基因在HUVEC細(xì)胞系中表達(dá)

2.5 ELISA檢測(cè)MCF-7和HUVEC細(xì)胞系中VEGF蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-182后，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白較對(duì)照組含量升高(P=0.021，見(jiàn)圖3)；而HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量升高更加顯著(P=0.004)，見(jiàn)圖4。

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of VEGF protein in the cell culture medium

圖4 MCF-7和HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量Fig.4 VEGF protein content in MCF-7 and HUVEC cell culture medium與si-NC組比較，*P<0.05

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證了FOXF2基因的688～695靶點(diǎn)為has-miR-182的靶點(diǎn)。細(xì)胞的CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染AntagomiR-182使其表達(dá)抑制，細(xì)胞增殖能力下降；對(duì)于低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-182使其過(guò)表達(dá)，細(xì)胞增殖能力有所提高，與預(yù)期結(jié)果相符。通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，AntagomiR-182可以抑制細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力；在MCF-7細(xì)胞中，miR-182可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力。轉(zhuǎn)染miR-182后，MCF-7和HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量均升高，但miR-182對(duì)VEGF基因基本沒(méi)有影響。

三陰性乳腺癌侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)早，預(yù)后差，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，缺乏內(nèi)分泌及抗HER-2治療靶點(diǎn)，是乳腺癌研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Liu等[6]報(bào)道了miR-182促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移，抑制其凋亡等；Kong等[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXF2低表達(dá)可能與乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Lei等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-182的高表達(dá)與乳腺癌的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，Hirata等[9]發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-182-5p可下調(diào)FOXF2促進(jìn)前列腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移，但目前尚無(wú)系統(tǒng)研究miR-182與靶基因FOXF2之間的相關(guān)性及其與TNBC病理學(xué)特征之間的關(guān)系。前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，miR-182在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)，并與差預(yù)后相關(guān)。本研究在FOXF2基因的3′UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)miR-182的結(jié)合位點(diǎn)(U1和U2)，可能是其潛在靶基因。3′UTR區(qū)域的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒驗(yàn)證，初步確認(rèn)FOXF2-U2為miR-182的靶基因。進(jìn)一步的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，has-miR-182通過(guò)與FOXF2基因的688～695靶點(diǎn)結(jié)合，降解靶基因FOXF2。CCK-8實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)表明，has-miR-182可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，提高癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移。miR-182作為乳腺癌促癌因素，直接作用于FOXF2基因，引起該基因下調(diào)，導(dǎo)致該通路所調(diào)控的細(xì)胞凋亡受到抑制，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和遷移，最終影響TNBC患者預(yù)后。進(jìn)一步的研究應(yīng)致力于闡明has-miR-182的致癌機(jī)制，從而更深入認(rèn)識(shí)TNBC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移影響因素。

[1] DREYER G, VANDORPE T, SMEETS A, et al. Triple negative breast cancer： clinical characteristics in the different histological subtypes[J]. Breast, 2013,22(5)： 761-766.

[2] TORRES A, TORRES K, MACIEJEWSKI R, et al. MicroRNAs and their role in gynecological tumors[J]. Med Res Rev, 2011,31(6)： 895-923.

[3] 趙君勇,房林.TBB對(duì)乳腺癌細(xì)胞miR-411表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,38(4)： 31-36.

[4] TOYAMA T, KONDO N, ENDO Y, et al. High Expression of MicroRNA-210 is an Independent Factor Indicating a Poor Prognosis in Japanese Triple-negative Breast Cancer Patients[J]. Jpn J Clin Oncol, 2012,42(4)： 256-263.

[5] CHIANG C H, HOU M F, HUNG W C. Up-regulation of miR-182 by beta-catenin in breast cancer increases tumorigenicity and invasiveness by targeting the matrix metalloproteinase inhibitor RECK[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1830(4)： 3067-3076.

[6] LIU H, WANG Y, LI X, et al. Expression and regulatory function of miRNA-182 in triple-negative breast cancer cells through its targeting of profilin 1[J]. Tumour Biol, 2013,34(3)： 1713-1722.

[7] KONG P Z, YANG F, LI L, et al. Decreased FOXF2 mRNA expression indicates early-onset metastasis and poor prognosis for breast cancer patients with histological grade II tumor[J]. PLoS One, 2013,8(4)： e61591.

[8] LEI R, TANG J, ZHUANG X, et al. Suppression of MIM by microRNA-182 activates RhoA and promotes breast cancer metastasis[J]. Oncogene, 2013,33(10)： 1287-1296.

[9] HIRATA H, UENO K, SHAHRYARI V, et al. MicroRNA-182-5p promotes cell invasion and proliferation by down regulating FOXF2, RECK and MTSS1 genes in human prostate cancer[J]. PLoS One, 2013,8(1)： e55502.