林 升， 羅丹丹， 李 琛， 孫 毅,

(1. 同濟大學醫(yī)學院再生醫(yī)學系，上海 200092； 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院干細胞臨床轉(zhuǎn)化中心，上海 200065)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)通常會造成永久性感覺及運動功能障礙，難以治愈。天冬酰胺內(nèi)肽酶(asparagine endopeptidase, AEP) 與年齡密切相關,在衰老大腦中表達上調(diào)并被活化。在酸性緩沖液中可剪切β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid β precursor protein, APP)以及Tau蛋白[1]，因而影響認知功能。而敲除了AEP基因的老年小鼠則不能剪切APP。最近，Emory大學Zhang等[2](KeqiangYe團隊)通過小分子藥物高通量篩選，找到AEP特異性小分子抑制劑，暫時命名為compound#11，4-(哌啶-1-取代)苯胺基團是其關鍵藥效基團。其能與AEP結(jié)合，在初級神經(jīng)元中阻斷APP和Tau蛋白的剪切[2]。脊髓損傷部位的炎性微環(huán)境中，由于K+大量外流[3]導致?lián)p傷部位細胞的胞內(nèi)基質(zhì)的pH值比正常組織略低，而且會大量表達某些種類的蛋白酶[4]。其中，損傷部位的AEP表達量上調(diào)，推測其活性也會升高。但是其是否有助于SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及功能的恢復尚不明確。所以，本研究觀察腹腔注射compound#11對SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及運動功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雌性C57BL/6小鼠28只，8～10周齡，體質(zhì)量(20±1.0)g，購于斯萊克動物實驗公司，由同濟大學動物實驗中心飼養(yǎng)，SPF級別。溫度(20±3)℃，濕度(50±20)%，每日光照12h，全營養(yǎng)鼠糧及適當飲食用水；compound#11由Keqiang Ye教授實驗室提供；丙戊酸(VPA)購于Sigma公司；解剖顯微鏡購于Olympus公司；Rotarod轉(zhuǎn)棒儀購于濟南益延科技公司；肌電誘發(fā)電位儀購于丹麥丹迪公司；顯微鏡和數(shù)碼攝像顯微圖像系統(tǒng)購于Leica公司；改造動脈夾，維持前端壓力恒定為60g。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型制作及給藥 (1) 動物分組。將28只C57BL/6小鼠隨機分為compound#11干預組、VPA干預組、生理鹽水對照組、假手術組，每組7只。(2) 小鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建。采用腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，背部去毛，將小鼠固定于手術臺上。除假手術組以外的3組小鼠，在外科顯微鏡下，縱行切開皮膚去除T9椎板，充分暴露T9脊髓節(jié)段后采用改造后的動脈夾鉗夾脊髓3s造成急性脊髓損傷模型。假手術組只行椎板切除術，未進行脊髓鉗夾。逐層縫合肌肉、皮膚，將術后小鼠安置于體溫維持墊上蘇醒；術后輔助小鼠排尿每日2次，每次排尿后使用碘伏消毒尿道。(3) 給藥方法。術后蘇醒30min給藥。compound#11干預組腹腔注射compound#11 10mg/kg，每日1次，連續(xù)28d；VPA干預組腹腔注射VPA 200mg/kg，每日1次，連續(xù)7d；生理鹽水對照組在每日相同時間點，腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)28d。

1.2.2 運動功能評價方法 術后7、14、21、28d，進行BMS評分、Rotarod檢測，對小鼠后肢運動功能進行評價。所有的行為學評價采用雙盲方法。BMS評分： 內(nèi)容包括后肢各關節(jié)活動度、后肢步態(tài)和協(xié)調(diào)性、運動時爪子的精細運動，主評分滿分9分，副評分滿分11分。Rotarod檢測： 依據(jù)小鼠在固定轉(zhuǎn)速下所能承受的最長時間，來比較組間差異。規(guī)定最長時間不超過60s。

1.2.3 電生理 采用運動誘發(fā)電位(motor evoked potentials, MEP)評價SCI后脊髓傳導功能完整性。評價指標包MEP的潛伏期、波幅。小鼠經(jīng)鹽酸氯胺酮注射液麻醉，測試均重復2次，確保結(jié)果的準確性。

1.2.4 組織形態(tài)觀察方法 H-E染色： 術后28d小鼠處死,取脊髓組織在4%多聚甲醛中固定,用石蠟包埋,連續(xù)切片,進行H-E染色,顯微鏡下觀察并拍照。免疫組化： 術后28d對小鼠進行在體灌注，分離出來的脊髓組織置于OCT中，并在液氮中冰凍OCT完全變成固體后，-80℃冰箱過夜。冰凍切片機切片后，滴加一抗、二抗進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 行為學評價

損傷后不同時間點各組小鼠BMS雙盲法評分見表1。28d后，compound#11干預組、VPA干預組、生理鹽水對照組BMS評分與假手術組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雖然compound#11干預組、VPA干預組與生理鹽水對照組相比無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但兩給藥組BMS評分在每一個時間點都高于生理鹽水對照組，評分呈總體升高的趨勢，見圖1。

表1 不同時間點各組BMS評分統(tǒng)計

在5r/min條件下，compound#11干預組、VPA干預組、生理鹽水對照組能夠承受最長時間分別為(18.9±0.75)、(18.7±0.85)、(16.5±1.07)s，均顯著低于假手術組[(60±0.00)s，P均<0.05]；compound#11干預組、VPA干預組高于生理鹽水對照組(P<0.05)。

雖然compound#11干預組、VPA干預組與生理鹽水對照組BMS評分無明顯差異，但在耐力實驗中，Rotarod能檢測到其差異性存在，見圖1～2。由此可知，損傷后需采用不同的敏感檢測方式全方面的評估功能恢復才能獲得更為完善、可靠的實驗數(shù)據(jù)。

2.2 組織學分析

損傷后28d，鉗夾損傷區(qū)軸突脫髓鞘明顯，神經(jīng)元減少，角質(zhì)細胞增生發(fā)生改變，受損部位的下行神經(jīng)元凋亡，膠質(zhì)瘢痕形成；生理鹽水組與compound#11干預組、VPA干預組相比，呈現(xiàn)出更加活躍的膠質(zhì)細胞增生以及更大的空洞面積，神經(jīng)元凋亡程度也稍重于其他給藥兩組，但是給藥組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3～4。

圖1 BMS評分Fig.1 BMS behavioral score

圖2 Rotarod檢測結(jié)果Fig.2 Results of Rotarod behavioral

圖3 術后28 d各組H-E染色結(jié)果Fig.3 H-E staining results of compound #11 group, VPA group, saline control groupA： compound#11干預組；B： VPA干預組；C： 生理鹽水組

圖4 術后28d兩組NeuN(b)染色結(jié)果Fig.4 NeuN staining results of compound #11 group, saline control groupA： compound#11干預組；B： 生理鹽水組

2.3 電生理檢測結(jié)果

MEP潛伏期的長短主要由脊髓的破壞程度來決定，從而反映神經(jīng)傳導速度。MEP波幅則一般反映刺激后，引起同步放電神經(jīng)元數(shù)量的多少。采用MEP來檢測損傷脊髓運動傳導功能，不同時間點各組小鼠神經(jīng)電生理檢查延長期結(jié)果見表2、潛伏期結(jié)果見表3。隨著手術后時間的延長，compound#11干預組、VPA干預組、生理鹽水組3組延長期波幅逐漸增加；compound#11干預組、VPA干預組、生理鹽水組3組潛伏期開始縮短。compound#11干預組、VPA干預組無論是延長期波幅還是延長期時間都比對照組的變化趨勢更好一些，但是3組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 不同時間點各組神經(jīng)電生理檢查延長期

表3 不同時間點各組神經(jīng)電生理檢查潛伏期

3 討 論

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要組成部分，脊髓損傷容易造成肢體癱瘓，如何提高神經(jīng)再生能力、促進神經(jīng)環(huán)路重建是脊髓損傷治療所面臨的重要科學問題。小分子藥物(small molecule drugs)是指一類可以影響信號轉(zhuǎn)導過程的小分子物質(zhì)，它們通過作用細胞中某些關鍵的信號通路，使其調(diào)控的下游信號通路得以抑制或激活[5]，具有神經(jīng)再生、保護作用和免疫調(diào)節(jié)作用，在維護內(nèi)源性神經(jīng)干細胞微環(huán)境方面具有廣闊的應用前景[6-9]。比如雷帕霉素是治療脊髓損傷是比較常用的一種小分子免疫抑制劑，減緩炎癥反應,提高神經(jīng)元的存活率[10]。本研究選擇VPA作為陽性對照組。VPA具有促進移植神經(jīng)干細胞修復脊髓損傷功能的作用，可以提高脊髓損傷后運動功能。但是單獨使用VPA給藥處理的小鼠與未處理的小鼠相比，并沒有顯著性改善，猜測VPA很可能是影響了移植細胞的功能[11]。

AEP是溶酶體產(chǎn)生的一種半胱氨酸蛋白酶,它可以在天冬氨酸殘基之后剪切蛋白質(zhì)。AEP在衰老大腦中表達上調(diào)并被活化,并能同時剪切APP和Tau蛋白[2]，從而影響認知功能，并發(fā)現(xiàn)敲除AEP基因的老年小鼠不能再剪切APP。最近,Zhang等[2](Keqiang Ye團隊)通過小分子藥物的高通量篩選,找到了AEP特異性小分子抑制劑compound#11，它能夠與AEP結(jié)合,在初級神經(jīng)元中阻斷對APP和Tau蛋白的剪切。通過對AD模型鼠給予compound#11，發(fā)現(xiàn)它具有明顯的認知及運動功能修復[12]。在脊髓損傷部位的炎性微環(huán)境中,由于K+大量外流[3]導致?lián)p傷部位細胞的胞內(nèi)基質(zhì)的pH值比正常組織略低,而且會大量表達某些種類的蛋白酶[4]。其中,損傷部位的AEP表達量上調(diào)。因此,推測其活性也會升高。并且，Zhang等[2](Keqiang Ye團隊)現(xiàn)已經(jīng)在周圍神經(jīng)損傷疾病模型上證實，compound#11也具有一定的神經(jīng)保護作用。但是compound#11在脊髓損傷部位是否會抑制AEP，阻斷其對APP和Tau蛋白的剪切，從而有助于SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及功能的恢復尚未有相關研究和文獻報道。本研究通過對脊髓損傷小鼠腹腔注射compound#11，觀察其對SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及運動功能的影響。

對于諸多行為學評價方法，哪種更加客觀，能夠反應真實情況目前并無一致結(jié)論。本實驗采用BMS評及Rotarod綜合評價，和單獨使用BMS評分法相比，更進一步細致、全面的評估小鼠后肢恢復過程中的行為學變化，并且與損傷程度有較高的契合度，結(jié)合評價可以判斷細小動作恢復情況。本研究結(jié)果提示，兩組給藥組與生理鹽水對照BMS評分無統(tǒng)計學差異，但是Rotarod測試證實小鼠行為學之間有明顯統(tǒng)計學差異。這些行為學評價方法雖便于推廣，但標準復雜，觀察人員須要有一定經(jīng)驗，并且至少兩名觀察者分別計分，以減少主觀因素影響。

隨著醫(yī)學電生理學的快速發(fā)展，人們逐漸認識到了誘發(fā)電位在療效評估和功能評定方面的重要性。其良好的客觀性與敏感性，已經(jīng)越來越多的運用于臨床SCI評價。MEP是繼SEP后檢測運動神經(jīng)系統(tǒng)設計的另一種神經(jīng)電生理檢查方法，提供了更加客觀、定量的依據(jù)。MEP潛伏期的長短主要由脊髓的破壞程度來決定，從而反映神經(jīng)傳導速度[13]。MEP波幅則一般反映刺激后，引起同步放電神經(jīng)元數(shù)量的多少。本研究采用MEP來檢測損傷脊髓運動傳導功能，發(fā)現(xiàn)隨著手術后時間的延長，compound#11干預組、VPA干預組、生理鹽水組3組延長期波幅逐漸增加，潛伏期開始縮短。但組間并無顯著性差異。

結(jié)合行為學，組織學以及電生理結(jié)果來看，compound#11干預SCI小鼠后與生理鹽水對照組相比，修復作用并沒有明顯統(tǒng)計學差異的原因可能是compound#11類似VPA，具有促進移植神經(jīng)干細胞修復脊髓損傷功能的作用，需要與移植干細胞或者其他治療方法協(xié)同治療脊髓損傷。

綜上所述，在脊髓損傷小鼠模型中，單獨使用compound#11修復脊髓損傷，具有一定改善作用，但其臨床藥用價值有待進一步探索?；诒疚臄?shù)據(jù)我們推測，聯(lián)合使用compound#11與干細胞移植或者其他治療方法協(xié)同治療，進而共同促進脊髓損傷的修復方式可能更為可行。

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