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寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一種可以通過伊蚊傳播給人類的單股正鏈RNA病毒[1]，屬黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)，分為非洲型和亞洲型兩個亞型[2]，主要傳播媒介是伊蚊，存在垂直傳播、血液傳播、尿液傳播、飛沫傳播、性傳播等方式[2]。ZIKV首先于1947年從烏干達寨卡森林中的恒河猴身上分離出來[3]，2007年密克羅尼西亞的雅浦島和2013年法國的波利尼西亞出現(xiàn)ZIKV大規(guī)模流行[4]。2015年ZIKV疫情在巴西進一步暴發(fā)，造成3萬多人感染，迅速蔓延至包括中國在內(nèi)的諸多國家，并有證據(jù)表明ZIKV感染與胎兒小頭癥[5]和嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(如吉蘭巴雷綜合征)有關[6]，已成為全球人類健康的潛在威脅。

ZIKV基因組全長約10.7 kb，含一條單一開放讀碼框(ORF)，病毒蛋白由一個單一的多蛋白前體經(jīng)宿主蛋白酶和病毒蛋白酶剪切而成[7]，包括3個結(jié)構蛋白(C、prM/M、E)和7個非結(jié)構(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)蛋白[8]。E蛋白相對分子質(zhì)量約55 kD，編碼E蛋白的基因位于基因組5′端，由1 515個堿基組成[9]。E蛋白是病毒主要的結(jié)構蛋白和包膜糖蛋白，與M蛋白共同構成病毒粒子表面結(jié)構[10]。當ZIKV入侵宿主細胞時，E蛋白與細胞表面的受體結(jié)合誘導病毒粒子包膜與細胞膜融合，通過內(nèi)吞作用使核衣殼進入細胞質(zhì)[11]。晶體結(jié)構的研究表明，寨卡病毒的E蛋白與其他黃病毒類似[12]，分為3個結(jié)構域：EDⅠ，EDⅡ和EDⅢ。EDⅠ處于中心區(qū)域，呈β桶狀結(jié)構，與病毒的致病性相關。EDⅡ呈指狀結(jié)構，可能參與病毒與宿主細胞的融合過程。EDⅢ為IgG免疫球蛋白樣結(jié)構，包含多個中和性抗原表位，可以結(jié)合宿主細胞表面受體引起病毒內(nèi)吞現(xiàn)象[13]。本研究擬利用ZIKV病毒株克隆表達重組E蛋白和EDⅢ，制備抗E蛋白和EDⅢ的多克隆抗體，為下一步單克隆抗體的制備和快速檢測膠體金試紙條的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1病毒株、載體、細胞、主要試劑和實驗動物 寨卡亞洲型病毒株ZIKV_SMGC-1(GenBank登錄號：KX266255.1)由武漢病毒所惠贈；Vero-E6細胞、蛋白原核表達載體pET28a(Kana+，His-tag)為本實驗室保存；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司；Ni-NTA親和層析樹脂購自GenScrip公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；HRP標記山羊抗鼠IgG購自Bioss公司；TMB顯色液購自Byotime公司；DAB顯色液購自Thermo公司。6周齡SPF級BALB/c雌鼠購自斯萊克實驗動物有限公司。

1.2寨卡病毒的增殖培養(yǎng)及RT-qPCR驗證 應用Vero-E6細胞培養(yǎng)ZIKV_SMGC-1病毒。取病毒凍存液100 μL加10 μL雙抗，4 ℃放置1 h除菌后接種于生長至70%的單層Vero-E6細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每隔15～30 min輕搖幾次以促進吸附，1h后棄去上清，加入胎牛血清含量為1%的DMEM維持液，置于37 ℃培養(yǎng)箱，24 h后顯微鏡觀察細胞致病變效應(CPE)。每天觀察一次，如果培養(yǎng)2～3周沒有CPE出現(xiàn)，則盲傳1代繼續(xù)觀察，直至盲傳3代后-40 ℃保存，再作進一步鑒定。出現(xiàn)CPE后收集細胞培養(yǎng)液，用試劑盒提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測病毒核酸。

1.3E蛋白的生物信息學分析和截短表達質(zhì)粒構建 從NCBI網(wǎng)站獲取ZIKV_SMGC-1基因組序列和E蛋白氨基酸序列，并用BLAST進行比對，選取相似性較高的其他幾個病毒的E蛋白氨基酸序列，采用Clustalx和MEGA4軟件進行同源性分析和系統(tǒng)進化樹構建。采用DNAstar Protean、ABCpred、IEDB-AR等軟件預測E蛋白抗原表位，使用TMHMM、DAS、TMpred、CCTOP等軟件預測E蛋白跨膜域區(qū)域。對預測結(jié)果進行綜合分析，去除跨膜區(qū)域后拼合成新的氨基酸序列，SWISS-MODEL對截短前后的E蛋白進行結(jié)構分析，并將去除跨膜域后的氨基酸序列送上海生工公司進行密碼子優(yōu)化，連接到原核表達載體pET32a(Amp+，His-tag)上(酶切位點為BamHⅠ和XhoⅠ)，通過全基因合成的方法得到重組表達質(zhì)粒，并將其命名為pET32a/E。

1.4EDⅢ基因擴增和表達質(zhì)粒構建 根據(jù)ZIKV_SMGC-1基因組中EDⅢ基因的序列，設計引物EDⅢ-F：5′-CCGGAATTCGCGTTCACATTCACCAAG-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)和EDⅢ-R：5′-CCGCTCGAGTTAACTCCTGTGCCAGTGGTGG-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點)。以病毒cDNA為模板，PCR擴增目的片段，EcoRⅠ和XhoⅠ同步雙酶切純化后的擴增產(chǎn)物和pET28a載體，高效連接酶對純化后的酶切產(chǎn)物進行連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，挑取PCR驗證為陽性的轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中并提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定后送上海生工測序，將驗證正確的質(zhì)粒命名為pET28a/EDⅢ。

1.5E和EDⅢ蛋白的原核表達及純化 將pET32a/E和pET28a/EDⅢ分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中活化，并按1∶50接種至500 mL LB培養(yǎng)基中，以不同濃度IPTG、不同誘導時間和溫度進行誘導，摸索最佳誘導條件。誘導后離心收菌并超聲破碎，收集上清，沉淀用8 mol/L尿素溶液重懸，用12%SDS-PAGE分析蛋白溶解性，考馬斯亮藍染色。用鎳柱親和層析法對收集的蛋白進行純化，采用咪唑溶液進行梯度洗脫，分別收集流穿液和洗脫液，12%SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況。如果是包涵體形式表達的蛋白則在純化后通過透析復性，并用超濾管超濾濃縮。

1.6動物免疫與抗血清制備 將純化的E蛋白和EDⅢ分別與等體積佐劑混合乳化，對6周齡BALB/c雌鼠進行皮下多點注射免疫，每只小鼠免疫的蛋白量約100 μg，每種抗原免疫4只小鼠。第1次免疫采用弗氏完全佐劑乳化，之后改用弗氏不完全佐劑，劑量不變，每2周免疫1次，共4次。末次免疫7 d后取尾血測效價，效價達標后取同劑量蛋白進行腹腔追加免疫。追加免疫3 d后摘眼球取血，12 000 r/min，離心10 min分離獲得血清即為多克隆抗體。

1.7多克隆抗體效價檢測 采用間接ELISA方法檢測抗體效價。以純化的E和EDⅢ為抗原，分別用蛋白包被液稀釋至0.01 mg/mL包被酶標板，3%BSA(PBST配置)封閉，用對應的多克隆抗體作為一抗，濃度從1∶200梯度稀釋至1∶409 600，HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5 000)作為二抗，PBST洗板。用TMB底物顯色，2 mol/L H2SO4終止顯色反應。使用酶標儀在λ=450 nm波長處讀取吸光度值，以P/N值≥2.1為陽性(P為陽性血清OD值，N為陰性對照OD值)。

1.8多克隆抗體特異性檢測 采用Western Blot方法檢測抗體特異性。純化的E蛋白和EDⅢ經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉(TBST配置)封閉，用對應的多克隆抗體(1∶5 000)作為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5 000)作為二抗，TBST洗膜。DAB顯色并掃膜存圖。取適量ZIKV_SMGC-1株全病毒裂解物高溫滅活并濃縮，分別以上述制備的E和EDⅢ多克隆抗體為一抗，以同樣方法進行Western Blot檢測。

2 結(jié) 果

2.1病毒cDNA熒光定量PCR驗證 病毒培養(yǎng)傳代一次后即出現(xiàn)CPE，從細胞培養(yǎng)液中提取病毒總RNA，使用試劑盒進行RT-qPCR方法檢測出寨卡病毒核酸，Ct值約為20(圖1)。

1: Positive control 2: Virus nucleic acid 圖1 RT-qPCR檢測細胞上清寨卡病毒Fig.1 RT-qPCR was used to detect cell supernatant Zika virus

2.2生物信息學分析 BLAST比對顯示寨卡E蛋白與斯龐德溫尼病毒(Spondweni virus，SPOV)相似性最高(75%)，Clustalx對寨卡病毒、斯龐德溫尼病毒、登革病毒、西尼羅河病毒和黃熱病毒的E蛋白進行多序列比對，結(jié)果顯示ZIKV E蛋白與SPOV E蛋白更加同源，使用MEGA軟件繪制系統(tǒng)進化樹如圖2。通過綜合分析幾種不同的預測方法，篩選出E蛋白的多處潛在抗原表位(如表1下劃線所示)和2個跨膜區(qū)域(位置為456～477和482～498，如表1陰影區(qū)域所示)。SWISS-MODEL建模結(jié)果表明去除跨膜域后的蛋白結(jié)構未發(fā)生改變(圖3)。

圖2 E蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.2 System phylogenetic tree of E protein

(a)Native E Protein (b)Recombinant E Protein圖3 E蛋白截短前后結(jié)構比對Fig.3 Structure alignment of E protein before and after truncation

表1 E蛋白抗原表位和跨膜區(qū)域預測
Tab.1 Epitope and transmembrane region prediction

2.3表達載體的構建與雙酶切鑒定 去除跨膜域后的E蛋白氨基酸長度為468 AA，基因長度為1 404 bp，合成的pET32a/E質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定出現(xiàn)與目的片段大小相符的條帶。EDⅢ插入pET28a載體后，提取重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，長度與目的片段大小(279 bp)一致(圖4)，測序比對顯示PCR擴增得到EDⅢ的全長示序列完全匹配。證實成功構建兩個重組表達質(zhì)粒。

(a) PCR of EDⅢ M: DNA marker; 1: Gene EDⅢ (b) Enzyme digestion of recombinant plasmids M: DNA marker; 2: Restriction enzyme digestion of pET32a/E; 3: Restriction enzyme digestion of pET32a/EDⅢ圖4 PCR及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 Fig.4 PCR and enzyme digestion of recombinant plasmids

2.4重組蛋白的表達與純化 重組轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE顯示分別在70 kD(圖5)和12 kD(圖6)處可見明顯條帶，與目的蛋白大小相符。經(jīng)不同濃度IPTG(0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L)、不同時間(4 h、8 h、12 h)和不同溫度(16 ℃、25 ℃、37 ℃)誘導并超聲破碎，SDS-PAGE證實蛋白表達量差別不大，且均存在于沉淀中，說明蛋白以包涵體的形式存在。將包涵體用尿素溶解后經(jīng)Ni+柱純化并透析復性，獲得了純度較高的E和EDⅢ蛋白。

M: Protein marker; 1: Non-induced pET32a; 2: Induced pET32a; 3: Non-induced pET32a/E；4: Induced pET32a/E; 5: Supernatant; 6: Precipitate; 7: Purified E圖5 SDS-PAGE檢測重組E蛋白的表達和純化Fig.5 Analysis of recombinant E protein by SDS-PAGE

M: Protein marker; 1: Non-induced pET28a; 2: Induced pET28a; 3: Non-induced pET32a/EDⅢ;4: Induced pET28a/EDⅢ; 5: Supernatant; 6: Precipitate; 7: Purified EDⅢ圖6 SDS-PAGE檢測重組EDⅢ蛋白的表達和純化Fig.6 Analysis of recombinant EDⅢ protein by SDS-PAGE

圖7 抗E蛋白多克隆抗體效價的測定Fig.7 Titer of the E polyclonal antibody

2.5多克隆抗體的效價檢測和特異性鑒定 間接ELISA法測定抗體效價，結(jié)果顯示8只小鼠均產(chǎn)生了較強的免疫反應。其中抗E蛋白多抗效價均達到1∶409 600(圖7)，抗EDⅢ多抗有3只達到1∶409 600，效價最低的1只也達到1：204 800(圖8)。Western Blot結(jié)果顯示免疫后的抗血清與對應的重組蛋白反應后分別在70 kD和12 kD處出現(xiàn)特異性免疫反應條帶(圖9)，與全病毒裂解物雜交后均在病毒天然E蛋白相應位置(55 kD) 出現(xiàn)條帶(圖10)，表明抗體與重組蛋白和ZIKV天然E蛋白均可以發(fā)生特異性反應。

圖8 抗EDⅢ蛋白多克隆抗體效價的測定Fig.8 The titer of the EDⅢ polyclonal antibody

M:Western blot marker;1:Purified E;2:Purified EDⅢ圖9 重組蛋白與多克隆抗體的免疫反應性Fig.9 Immunogenicity of recombinant protein with polyclonal antibodies

M: Western blot marker; 1: E polyclonal antibody; 2: EDⅢ polyclonal antibody圖10 天然蛋白與多克隆抗體的免疫反應性Fig.10 Immunogenicity of native protein with polyclonal antibody

3 討 論

在2015年以前，ZIKV曾經(jīng)由于感染人數(shù)較少且成年患者癥狀不明顯而沒有引起足夠重視。近年來其疫情多次暴發(fā)并迅速蔓延，且有研究證實其為吉蘭巴雷綜合征和新生兒小頭癥的病因之一，已經(jīng)成為威脅全球人類健康的潛在因素，目前尚無針對性的預防性疫苗和治療性藥物，世界衛(wèi)生組織(WHO)曾在2016年2月宣布將寨卡病毒列為全球公共衛(wèi)生緊急關注事件[14]。因此對于ZIKV致病機制、免疫策略、治療手段的研究已經(jīng)是當務之急。生物信息學分析顯示，ZIKV在黃病毒屬中與斯龐德溫尼病毒關系最為密切，與西尼羅河病毒、登革熱病毒、黃熱病毒等分離而單獨成簇。這表明盡管ZIKV與其他黃病毒發(fā)病癥狀相似，但是可能已經(jīng)發(fā)展出不同的疾病機制。

位于病毒表面的E蛋白是決定ZIKV毒力的關鍵蛋白，也是誘導機體產(chǎn)生免疫保護的重要蛋白，Dai等[15]解析了與黃病毒廣泛中和抗體2A10G6復合的ZIKV E蛋白的結(jié)構，并證明該抗體可以體外中和和小鼠體內(nèi)保護ZIKV感染。E蛋白結(jié)構的解析也證實了ZIKV與其他黃病毒之間潛在的差異性，最主要的是糖基化位點的改變，這種變化可能是決定抗體特異性的重要因素[16]。EDⅢ是病毒與宿主細胞吸附的關鍵區(qū)域，也是E蛋白最主要的抗原區(qū)域[17]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多強毒黃病毒型特異性中和單克隆抗體(mAb)靶向EDⅢ[18]。Zhao等[19]通過使用ZIKV活病毒注射小鼠開發(fā)出針對ZIKV的6種單克隆抗體，其中有4種具有中和活性，可以中和不同型毒株的感染，這4種mAb中有3種靶向EDⅢ，還有1種靶向EDI和EDII之間的融合環(huán)區(qū)域。Yang等[20]描述了EDⅢ作為蛋白質(zhì)亞基疫苗候選物的免疫原性，并且其抗體不會增強登革熱病毒的感染。

盡管單克隆抗體具有特異性高、純度高、交叉反應少等特點，但相比之下多克隆抗體具有制備過程簡單、周期短、成本低等優(yōu)勢[21]，而且可以識別任一抗原上的多個表位，有助于放大低表達水平的靶蛋白信號，從而提高檢測的靈敏度[22]。本研究首先嘗試表達E蛋白全長，但是表達量極低且難以純化，為提高表達效率，采用了去除跨膜區(qū)域后截短表達的方法。生物信息學分析結(jié)果表明可能的抗原表位不在這兩個跨膜域中，同源建模的結(jié)果也表明蛋白結(jié)構未發(fā)生改變，因此截短表達不影響該蛋白的抗原性。全長的EDⅢ則表達量較高且易于純化。但是優(yōu)化誘導條件之后的兩種蛋白仍然以包涵體形式表達，可能是由于蛋白自身疏水性較高，因此采用尿素溶解和梯度透析的方式使蛋白復性，獲得表達量和純度均較高的重組E蛋白與EDⅢ。最終通過免疫BALB/c小鼠制備出高效價、高特異性的多克隆抗體。盡管本研究表達的兩個蛋白都非完整的E蛋白，但由于兩者均含有E蛋白的主要抗原表位，具有良好的免疫原性，均可以誘導小鼠產(chǎn)生高水平的免疫反應，所制備的多克隆抗體不僅可以特異性識別重組蛋白，而且能夠從ZIKV全病毒裂解物中檢測到完整的天然E蛋白。

本研究成功制備的多克隆抗體可用于E蛋白的結(jié)構和功能研究，也可用于ZIKV血清學診斷方法的研究，為深入探索E蛋白在ZIKV感染致病機理中的作用機制以及疫苗的開發(fā)奠定了研究基礎。

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