， ，，，，，

流行性感冒病毒(influenza virus)，簡(jiǎn)稱流感病毒，自流感被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，每年在全球范圍內(nèi)都有季節(jié)性流行[1]，流感病毒的基因分子進(jìn)化及疫苗研究一直是各地學(xué)者研究的熱點(diǎn)。流感H3N2亞型在流感暴發(fā)流行歷史中扮演重要角色，其一直在人群中流行傳播，并發(fā)生變異。流感病毒的抗原性變異主要指血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原結(jié)構(gòu)的改變，其中以HA最為重要，變異也最為顯著[2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)推出疫苗株也一再更新。從近幾年全球的流行病學(xué)調(diào)查分析可以看出，H3N2亞型在大多數(shù)國(guó)家是流感流行的優(yōu)勢(shì)毒株，我國(guó)也以甲型H3N2病毒為優(yōu)勢(shì)株。僅1968-1992年間我國(guó)發(fā)生的10次流感，其中就有7次都是由H3N2亞型流感病毒所引起[3]。商洛市對(duì)流感研究起步較晚，開始于2009年流感疫情再次席卷全球。本課題依托中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)平臺(tái)，收集2014-2015年商洛市國(guó)家流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室流感H3N2亞型毒株，了解商洛市流感病毒進(jìn)化規(guī)律，以及流行趨勢(shì)，與WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)疫苗株及國(guó)內(nèi)毒株進(jìn)行比對(duì)，研究流行株與疫苗匹配性，為當(dāng)?shù)亓鞲懈呶Ｈ巳哼x擇性預(yù)防接種工作提供參考，對(duì)減少發(fā)病率，減輕公共衛(wèi)生預(yù)防控制工作負(fù)擔(dān)有重要意義。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 根據(jù)《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南(2010年版)》(下文簡(jiǎn)稱《指南》)，收集流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院商洛市中心醫(yī)院流感樣病例(influenza-like illness, ILI)，ILI是指發(fā)熱(體溫大于等于38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者，同時(shí)缺乏其他實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。用病毒采樣管(友康)2～8 ℃冷藏保存，12 h內(nèi)送商洛市疾病預(yù)防控制中心國(guó)家流感監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)核酸提取儀(西安天隆NP968)；全自動(dòng)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(上海宏石SLAN-96P)；PCR儀(美國(guó)Bio-Rad PTC-200)；電泳儀(北京六一DYY-2C)；凝膠成像儀(海南黑馬GSG-2000)。核酸提取由西安天隆提供配套商品試劑盒；實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)A、B及H3亞型分型采用上海之江商品試劑盒；MDCK細(xì)胞由陜西省疾病預(yù)防控制中心提供；鑒定血清由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家流感中心提供；PCR使用QIAGEN公司One Step RT-PCR Kit試劑盒。

1.3 方法

1.3.1核酸檢測(cè) 對(duì)流感哨點(diǎn)醫(yī)院ILI標(biāo)本用全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸(按產(chǎn)品說(shuō)明書操作)，用上海之江核酸檢測(cè)試劑對(duì)核酸提取物進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)(按產(chǎn)品說(shuō)明書操作)。

1.3.2病毒分離培養(yǎng) 將核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本用單層狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)進(jìn)行分離培養(yǎng)，收集細(xì)胞病變(CPE)“+++”～“++++”的樣本，用豚鼠血球或火雞血球進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)，陽(yáng)性毒株(HA>1∶8)用血凝抑制試驗(yàn)(HI)進(jìn)行鑒定分型。

1.3.3序列測(cè)定 將鑒定為H3標(biāo)本病毒培養(yǎng)液用全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸，具體操作見說(shuō)明書；提取核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)及合成由上海之江生物公司提供(引物合成自Thermo Fisher)，引物序列見表1；PCR后，用1%瓊脂糖凝膠電泳；陽(yáng)性條帶送上海美吉生物醫(yī)學(xué)有限公司測(cè)序。

表1 引物核苷酸序列
Tab.1 The nucleotide sequence of the primer

PrimerSequenceTmLength/bpYF?HA?H3?35′?ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGC?3′59768YF?HA?H3?95′?TCCCGGTTTTACTATTGTCCA?3′59．3YF?HA?H3?55′?TCAAAAYGGAACAAGCTCTGC?3′60．4676YF?HA?H3?65′?TTGATGCCTGAAACCGTACC?3′60．9YF?HA?H3?75′?TGAAATTGGCAACAGGGAT?3′58．9714YF?HA?H3?85′?CTCAAATGCAAATGTTGCAC?3′57．8

1.3.4序列分析 將所得的測(cè)序結(jié)果應(yīng)用clustax2.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)后，應(yīng)用Mega 6.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹采用Neighboring-joining方法及Kimura-2-Parameter模式進(jìn)行繪制，Bootstrap值進(jìn)行1 000次重復(fù)運(yùn)算。以WHO推薦2014-2015年H3N2標(biāo)準(zhǔn)疫苗株A/Texas/50/2012[4]為對(duì)照進(jìn)行氨基酸變異分析。

2 結(jié) 果

2.1HA1片段的序列分析與同源性分析 本研究得到毒株的HA1序列為987 bp，編碼329個(gè)氨基酸。以A/HongKong/1/1968的HA1基因?yàn)榛鶞?zhǔn)，對(duì)分離H3N2毒株HA1基因構(gòu)建核苷酸序列進(jìn)化樹，見圖1。季節(jié)性H3N2的HA1基因在不斷變異，進(jìn)化基本按時(shí)間順序逐漸演變，但2014-2015年在進(jìn)化樹上有交替過渡出現(xiàn)。2014-2015年分離毒株同源性在97.2%～99.9%，分離毒株與2014-2015年標(biāo)準(zhǔn)疫苗株A/Texas/50/2012同源性為97.3%～98.5%(表2)。

表2 流感H3N2基因HA1同源性分析
Tab.2 Analysis homology of the HA1 genes of influenza A(H3N2)

2.2H3N2亞型流感病毒HA1特異性分析 2014年商洛市分離的H3N2毒株與2014-2015年推薦疫苗株A/Texas/50/2012相比，其HA1亞基氨基酸變異點(diǎn)主要有I3L、T128N、Y159F、K171N、S198P、I312K、E322G；2015年商洛市分離的H3N2毒株與2014-2015年的疫苗株A/Texas/50/2012(H3N2)相比，其HA1亞基氨基酸變異點(diǎn)主要有N124S、A128N、S138A、G142R、S159F、S198P、G223E、E260K、T313A、E322G、D327N，見表3。

表3 流感H3N2亞型HA1基因氨基酸變異分析
Tab.3 Amino acid variation of HA1 nucleotide of influenza A(H3N2)

StrainsAminoacidvariationsites3124128138142159171198223260312313322327A/Texas/50/2012＿VaccineLSNARFNPEKKAGNA/ShangLuo/06/2014--T--Y-S--I-E-A/ShangLuo/173/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/182/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/244/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/04/2015-NASGS-SGE-TEDA/ShangLuo/15/2015-NASGS-SGE-TEDA/ShangLuo/30/2015-NASGS-SGE-TED

2.3HA1潛在糖基化位點(diǎn) HA蛋白在細(xì)胞轉(zhuǎn)移中進(jìn)行糖基化加工修飾，H3N2HA蛋白至少有7個(gè)N糖基化位點(diǎn)，其中6個(gè)位于HA1，其序列為N-X-T/S(N-天冬氨酸,T-蘇氨酸,S-絲氨酸,X-任意氨基酸)。HA1分子含有大量的糖類，大部分位于氨基酸的末端，其位點(diǎn)增加或減少對(duì)流感病毒的抗原性及其他生物學(xué)特性均有一定影響[5]。用在線糖基化預(yù)測(cè)分析潛在的糖基化位點(diǎn)[6]。2014-2015年商洛市分離毒株的HA1的氨基酸與疫苗株A/Texas/50/2012相比糖基化位點(diǎn)沒有變化。

2.4二硫鍵的變化 流感病毒HA蛋白分子上有6個(gè)二硫鍵，其中5個(gè)位于HA1區(qū)，包括HA1第14位的半胱氨酸與HA2第137位的半胱氨酸之間形成的將HA1和HA2相連的二硫鍵；其余4個(gè)二硫鍵分別為HA1的52與277、62 與67、97 與139、281 與305的半胱氨酸之間形成的二硫鍵[7-9]。本次研究分析中2014-2015年度商洛市的流感毒株的HA1區(qū)5個(gè)二硫鍵均未發(fā)現(xiàn)氨基酸替換、缺失和插入。

3 討 論

2009年以來(lái)，商洛市流感病毒流行株主要在A型H1N1(2009)、季節(jié)性H1、H3N2及B型Yamagata、Victoria亞型之間交替出現(xiàn)，當(dāng)流感出現(xiàn)一種新的亞型，由于人群缺乏特異性的免疫，人類普遍易感。商洛市位于北方片區(qū)，屬于暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)山地氣候，流感流行季節(jié)明顯，流行高峰一般會(huì)在每年11月到次年3月份左右，夏秋季流感病例很少檢出。從2012-2015年，流感H3N2亞型逐漸增多并成為北方地區(qū)優(yōu)勢(shì)毒株流行株[10-11]，其主要原因：一是流感變異速率快、幅度大，容易逃脫宿主的識(shí)別和清除，缺乏依賴RNA的RNA聚合酶的校正作用，導(dǎo)致毒株變異；二是受人群免疫力自然選擇的壓力。本研究中流感H3N2亞型HA1基因進(jìn)化樹沿主干隨時(shí)間逐漸向上延伸，其分支較短，提示毒株變異很快，且2014-2015年毒株有交替出現(xiàn)。從進(jìn)化樹可以看到2014年毒株與疫苗株A/Texas/50/2012距離較近，而2015年毒株則與疫苗株A/Texas/50/2012較遠(yuǎn)，說(shuō)明商洛市H3N2毒株受到的人群免疫力較大。

流感病毒的HA蛋白以三聚體(trimer)的形式存在于雙層類脂膜上，由3個(gè)非共價(jià)結(jié)合的HA蛋白單體所組成。HA蛋白三聚體可分為呈桿狀的基底部及呈球狀的頭部，HA1主要組成其頭部。病毒受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)位于HA頭部，呈淺袋狀，其中98Y、153 W、155T、183H、190E和194L的氨基酸殘基組成口袋裝的表面；224位～228位和134位～138位這2個(gè)區(qū)域分別構(gòu)成受體結(jié)合部位的左右緣[12]。大部分流感病毒株HA1的5個(gè)氨基酸(98、153、183、190 和 194)是高度保守的，不參與RBS位點(diǎn)與受體結(jié)合，可能對(duì)穩(wěn)定RBS結(jié)構(gòu)、促進(jìn)病毒與受體結(jié)合和病毒繁殖等生理功能起到重要的作用[13-14]。2015年商洛市分離毒株發(fā)生S138A變異，提示病毒結(jié)合位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)有可能改變，應(yīng)當(dāng)引起重視，這與羅鵬飛[15]等人研究結(jié)果相同。此外RBS的某些結(jié)構(gòu)組成部分結(jié)構(gòu)及其位點(diǎn)發(fā)生了變異，說(shuō)明這些RBS結(jié)構(gòu)組成部分可能同時(shí)作為抗原抗體的相互作用位點(diǎn)，宿主的細(xì)胞免疫可能參與了對(duì)抗流感病毒的過程[16]。

X線晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，H3N2亞型流感病毒HA蛋白上的抗原決定簇分為5個(gè)區(qū), A 區(qū)包括133～137位和140～146位形成的突出的環(huán)上, B區(qū)位于155位上的主環(huán)156～160位及球區(qū)末端圍繞著α 螺旋結(jié)構(gòu)的187～198位。C區(qū)位于球區(qū)下方的 53、54、275、278位, 由52位和277位的形成的膨脹部分所在區(qū)。D區(qū)由207位和174位組成。E區(qū)由63、78 、81、83位組成[17]。流感HA1氨基酸在快速、持續(xù)不斷的發(fā)生突變，但主要是以嘌呤A/G或嘧啶C/T互換最為常見，嘌呤與嘧啶間的置換較少。近幾年，由于很難獲得雞胚分離的H3N2亞型流感病毒，且H3N2亞型流感病毒在雞胚分離時(shí)抗原決定簇發(fā)生適應(yīng)性突變，因此WHO推薦使用A/Texas/50/2012-likevirus作為疫苗組分[18-19]。2014-2015年商洛市分離H3N2毒株與WHO推薦疫苗株HA1基因氨基酸比較，2014年其主要抗原決定簇氨基酸變異點(diǎn)有B區(qū)Y159F、S198P；2015年主要抗原決定簇氨基酸變異點(diǎn)有A區(qū)G142R，B區(qū)S159F、S198P，馬萍[20]等在陜西省2011-2013年H3N2流感流行趨勢(shì)分析中發(fā)現(xiàn)2011-2012年抗原變異有B區(qū)S198A位,2012-2013年抗原變異位點(diǎn)有A區(qū)G142R，李希妍[21]等對(duì)2013-2014年中國(guó)H3N2亞型研究發(fā)現(xiàn)HA基因序列也有G142R、S198P位點(diǎn)變異。流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚分離傳代中會(huì)產(chǎn)生序列變異，但結(jié)合本地區(qū)流感H3N2亞型流行株與中國(guó)疾病預(yù)防控制中心上述相關(guān)研究，A/Texas/50/2012疫苗株已連續(xù)使用兩年，而且對(duì)流行株與疫苗株抗原決定簇氨基酸比較，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)產(chǎn)生多位點(diǎn)突變，這可能會(huì)導(dǎo)致病毒抗原性發(fā)生較大改變。因此應(yīng)該及時(shí)對(duì)我國(guó)流感H3N2亞型疫苗組分進(jìn)行更新。

綜上所述，2014-2015商洛市流感監(jiān)測(cè)年度流感流行株以H3N2為主，且WHO推薦疫苗株組分匹配性已不是最佳，急需更新，其主要原因可能受環(huán)境因素及人群活動(dòng)影響，與本地區(qū)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)，人群流感疫苗接種率普遍偏低，病毒抗原的不斷變異，病毒逃避免疫等機(jī)制相關(guān)。因此對(duì)流感抗原變異情況及時(shí)監(jiān)測(cè)分析，對(duì)預(yù)測(cè)流感流行情況、疫苗匹配性及篩選有重要意義和參考價(jià)值。

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