黃生輝， 鞏 婷， 李妍怡△

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院, 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 3. 甘肅省中醫(yī)院腦病科， 4. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 蘭州 730000)

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是在腦血管血流動力學(xué)改變或粥樣動脈硬化等腦血管壁病變的基礎(chǔ)上發(fā)生腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致相應(yīng)供血區(qū)腦組織由于缺血、缺氧而出現(xiàn)腦組織壞死或軟化，并引起短暫或持久的局部或彌漫性損害，表現(xiàn)為一系列神經(jīng)功能缺損的臨床癥候群[1]。該病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，居腦血管病死亡原因之首，給社會及家庭造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]，而促進(jìn)神經(jīng)再生是腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一類存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有高度增殖、自我更新及分化能力，在一定條件下能不斷進(jìn)行有絲分裂并分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的原始母細(xì)胞[3]。已有大量研究顯示：單味中藥、中藥有效成分、中藥提取物、中藥復(fù)方對神經(jīng)干細(xì)胞具有調(diào)控作用，可以促進(jìn)缺血性腦血管疾病神經(jīng)再生與修復(fù)[4-5]。氣虛血瘀是缺血性腦卒中發(fā)病的基本病機(jī)，“益氣活血法”符合缺血性腦卒中正氣虧虛、瘀血凝滯的病機(jī)本質(zhì)。氣為血之帥，血為氣之母；氣行則血行，氣滯則血瘀。血液在脈中周流不息，有賴于氣的推動；而氣亦需血的滋養(yǎng)。氣虛無力，不能推動血液運(yùn)行，出現(xiàn)氣虛血瘀或氣滯血瘀；而瘀血久留，耗傷正氣還會加重氣虛[6]。通過益氣活血的治療方法可以通過改善血流，促進(jìn)神經(jīng)再生等而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。體現(xiàn)“益氣活血法”的中風(fēng)膏在臨床上治療缺血性腦血管病，凡屬氣虛血瘀證者，具有良好的臨床療效。因此，通過中醫(yī)藥促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生修復(fù)，是治療缺血性腦血管疾病一個有巨大希望的治療策略，為缺血性腦卒中的治療展現(xiàn)美好的前景。因此，本實(shí)驗(yàn)采用體外氧糖剝奪/再復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)損傷模型模擬體內(nèi)腦缺血缺氧再灌注的損傷，觀察體現(xiàn)“益氣活血法”的中風(fēng)膏對海馬NSCs 細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠，由上海斯萊克公司提供，SCXK(瀘)2012-0002(合格證號：0286597)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12( 1∶1) 、B27 添加劑購自Gibco 公司，D-Hanks 液、胎牛血清購自Hyclone公司，堿性成纖維細(xì)胞生長因子( basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)均購自Peprotec公司。鼠抗Nesti多克隆抗體分別購自 Santa Cruz 和 Cell Signaling Technology 公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。CCK8 試劑盒、多聚賴氨酸溶液和DAPI 染色液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。全波長酶標(biāo)儀：SpectraMax Plus 384型，美國MD；流式細(xì)胞儀：Accuri C6，BD公司。

1.3 海馬神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)

參照 Hiroaki等[7]方法取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠，75%酒精消毒，無菌條件下迅速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬；將組織剪成1 mm3小塊，用NSCs培養(yǎng)基重懸，輕柔吹打1 min，靜置1 min后吸取細(xì)胞懸液至15 ml離心管中，往沉淀中加入培養(yǎng)基，吹打1 min，靜置1 min，吸取細(xì)胞懸液至15 ml離心管中，如此反復(fù)操作至無肉眼可見組織塊；將收集的細(xì)胞懸液依次通過200目的濾網(wǎng)，離心、棄去上清液，用NSCs 培養(yǎng)基重懸；調(diào)整細(xì)胞密度在5×105cells/ml，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)5～7 d后當(dāng)神經(jīng)球直徑達(dá)到100～200 μm時，采用含終濃度為20 ng/ml的bFGF和EGF、2% B27添加劑、1%雙抗、1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12(1∶1)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。接種于預(yù)先多聚賴氨酸(0.1 mg/ml)包被過的培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用穩(wěn)定生長的第三代懸浮神經(jīng)球。

1.4 海馬神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定[8]

將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸棄，PBS洗2次，每次3 min；4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗2次，每次3 min；0.1%TritonX-100室溫破膜20 min，PBS洗2次，每次3 min；2%FBS室溫封閉30 min；加入適當(dāng)稀釋比例的一抗(Nestin：PBS=1∶100)，4℃孵育過夜；PBS洗3次，每次3 min，加入適當(dāng)稀釋比例的熒光二抗(1∶800)，4℃避光孵育1 h；PBS洗2次，每次3 min，加入1 μg/ml的DAPI，4℃避光孵育30 min；PBS洗2次，每次3 min，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 神經(jīng)干細(xì)胞氧糖剝奪/再復(fù)氧(OGD/R)損傷模型的構(gòu)建[9]

除去神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，D-Hanks 液清洗 3 次，將培養(yǎng)液改為 D-Hanks 液，置于 37℃三氣培養(yǎng)箱缺氧2 h，通以體積分?jǐn)?shù)分別為1% O2、5%CO2和94%N2混合氣體。氧糖剝奪后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，并置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng) 24 h。

1.6 CCK8法實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案

具體分為正常組、模型組、中風(fēng)膏5%含藥血清組、中風(fēng)膏10%含藥血清組、中風(fēng)膏20%含藥血清組。共設(shè)1 d、3 d、5 d、7 d四個時間點(diǎn)。(1)正常對照組:用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在常規(guī)37℃，5%CO2培養(yǎng)箱下培養(yǎng)；(2)模型組: 用含10%正常大鼠血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞在給予缺氧復(fù)氧處理后，再在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2 h；(3)中風(fēng)膏5%含藥血清組:在復(fù)氧后加入含5%中風(fēng)膏含藥血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，其余過程同模型組。(4)中風(fēng)膏10%含藥血清組:在復(fù)氧后加入含10%中風(fēng)膏含藥血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(取正常大鼠外周血離心分離出血清，經(jīng)56℃水浴30 min滅活。取10%體積分?jǐn)?shù)加入DMEM/F12培養(yǎng)基中。37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，其余過程同模型組。(5)中風(fēng)膏20%含藥血清組:在復(fù)氧后加入含20%中風(fēng)膏含藥血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，其余過程同模型組。

1.7 含藥血清制備

中風(fēng)膏為甘肅省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由醫(yī)院制劑室提供，批號：20161018。配方: 岷當(dāng)歸、黃芪、川芎、赤芍等；中風(fēng)膏治療組:1 ml/100 g灌胃。取260～280 g體重的SD大鼠20只，隨機(jī)分為中藥血清組、正常血清組，每組10只大鼠。給藥前均禁食12 h(自由飲水)。根據(jù)中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，灌胃藥量按人與大鼠體表面積公式換算后成人給藥的10倍灌胃。最大灌胃量不超過1 ml/100 g，用以制備含藥血清。正常對照組則給予2 ml生理鹽水灌胃。每天給藥2次，每次1 ml，連續(xù)給藥3 d，末次給藥后1～2 h采血。10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，4℃離心分離血清(3 000 r/min，20 min)，56℃滅活30 min后經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾除菌，將每組大鼠的血清混合后，分裝至1 ml離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 CCK8 法檢測中風(fēng)膏含藥血清對NSCs增殖的影響

消化神經(jīng)干細(xì)胞，以100 μl體系5×103個/孔接種至 96 孔培養(yǎng)板，每組6個復(fù)孔OGD/R造模后，棄去96 孔板內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔避光加入100 μl 含體積分?jǐn)?shù)為 0.1CCK8溶液。37℃孵育1 h后終止培養(yǎng)。使用空白對照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定 450 nm 處吸光度值，結(jié)果以O(shè)D值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.9 流式細(xì)胞學(xué)法檢測中風(fēng)膏含藥血清對NSCs凋亡的影響

取對數(shù)期生長的神經(jīng)干細(xì)胞，消化成單細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔調(diào)整密度至1×106個。OGD/R造模后，用體積分?jǐn)?shù)為0.0025胰蛋白酶將細(xì)胞消化，體積分?jǐn)?shù)為 0.1胎牛血清中和胰蛋白酶，1 000×g離心5 min，棄去上清液，預(yù)冷的PBS洗2次離心棄上清用500 μl 1×Binding buffer 重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC、PI染料4℃避光孵育10 min，上機(jī)檢測。流式結(jié)果分為四個象限：左上為死細(xì)胞占全部檢測細(xì)胞比、左下為正?；罴?xì)胞占全部檢測細(xì)胞比、右下為早期凋亡細(xì)胞占全部檢測細(xì)胞比、右上為晚期凋亡細(xì)胞占全部檢測細(xì)胞比?？偟蛲雎?早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

傳代后形成的海馬神經(jīng)干細(xì)胞克隆球Nestin 間接免疫熒光染色，經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物 Nestin 鑒定為陽性(圖1，2，見彩圖頁Ⅳ)。提示培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 中風(fēng)膏對OGD/R損傷后海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

通過CCK8 法檢測神經(jīng)干細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞在培養(yǎng)1～7 d內(nèi)增殖明顯，模型組細(xì)胞在造模后各個時間點(diǎn)增殖能力均明顯下降，在細(xì)胞造模后加入中風(fēng)膏含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在3 d 20%濃度中風(fēng)膏含藥血清培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的增殖能力較模型組增強(qiáng)。而在5 d、7 d兩個時間點(diǎn)含藥血清組增殖能力均較模型組明顯上升且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，證明含藥血清對干細(xì)胞OGD/R損傷后的增殖能力有顯著的修復(fù)作用(圖3)。

2.3 中風(fēng)膏對 OGD/R損傷后海馬神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響

據(jù)2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取藥物作用效果最為明顯的7 d時間點(diǎn)和20%含藥血清組進(jìn)行細(xì)胞凋亡時間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞相比模型組出現(xiàn)非常明顯的晚期凋亡，證明OGD/R對干細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。而20%中風(fēng)膏含藥血清培養(yǎng)組凋亡相比模型組有顯著下降(P<0.01)，結(jié)果證明20%中風(fēng)膏含藥血清對干細(xì)胞損傷有治療作用，可降低細(xì)胞凋亡(圖4)。

Fig.3The proliferation of NSCs cells after OGD/R treatmenttested by CCK8 experiment(n=6)

ck: Normal group; mock: Model group; ZFG 5%: 5% ZhongFengGao containing serum; ZFG 10%: 10% ZhongFengGao containing serum; ZFG 20%: 20% ZhongFengGao containing serum

**P<0.01vsck；##P<0.01vsmock

Fig.4The apoptosis rate of NSCs cells after OGD/R treatment(n=3)

A: Normal group; B: Model group; C: 20% ZhongFengGao containing serum; D: Statistical analysis of apoptosis experiment

**P<0.01vsmock

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)與再生一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),中藥為重要手段的中醫(yī)藥療法為腦缺血后神經(jīng)再生的研究提供了新的思路[10]。缺血性腦卒中主要病機(jī)為氣虛血瘀，“益氣活血法”為中醫(yī)治療缺血性腦卒中的基本方法，有著明確的不可替代的作用，其有效性和安全性已經(jīng)得到臨床驗(yàn)證[11]。體現(xiàn)“益氣活血法”的“中風(fēng)膏”為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，以古方“佛手散”(當(dāng)歸、川芎)為基礎(chǔ)，重用岷當(dāng)歸(達(dá)藥典規(guī)定的6倍)，配伍黃芪、丹參、赤芍、羌活、甘草等藥物，具有較強(qiáng)的益氣活血，化瘀通絡(luò)的功效，為“益氣活血法”的代表方藥之一，中風(fēng)膏能夠有效降低血黏度、抑制頸動脈粥樣斑塊、抑制血小板聚集、減輕鈣超載、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，具有明確的神經(jīng)保護(hù)和改善微循環(huán)作用，具有良好的臨床療效[12-15]?！耙鏆饣钛ā奔捌浯碇兴帍?fù)方通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，能通過促進(jìn) NSCs增殖與分化，進(jìn)而有利于損傷的神經(jīng)細(xì)胞再生，有利于腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)[16, 17]。黃芪為補(bǔ)氣藥，三七為活血藥，配伍符合中醫(yī)治療缺血性腦卒中的益氣活血的治療法則，兩者單獨(dú)應(yīng)用均可促進(jìn)NSCs 增殖,張建平等研究提示，黃芪皂苷(50 μg/ml)和三七總皂苷(15 μg/ml)配伍可明顯逆轉(zhuǎn) OGD-R 所致海馬 NSCs 的LDH漏出率增高、存活率降低及核萎縮或凋亡發(fā)生[18]。

神經(jīng)干細(xì)胞除具有自我更新和多向分化的潛能外，還具有以下幾個方面的特征[19]：(1)對損傷部位具有反應(yīng)能力：通過產(chǎn)生新生的神經(jīng)細(xì)胞而修復(fù)受損神經(jīng)組織；(2)具有遷移作用和良好的組織相容性：當(dāng)神經(jīng)發(fā)生損傷后，神經(jīng)干細(xì)胞從腦室向神經(jīng)損傷區(qū)域方向遷移，達(dá)到神經(jīng)修復(fù)的目的。海馬是腦內(nèi)對缺氧最為敏感的部位，是執(zhí)行學(xué)習(xí)、記憶等高級功能的腦區(qū)，也是NSCs的主要分布腦區(qū)之一，在體外培養(yǎng)的海馬 NSCs較適用于缺血性腦損傷模型的建立及其相關(guān)研究[20]。懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)是神經(jīng)干細(xì)胞常用的兩種培養(yǎng)方法，本研究采用無血清懸浮培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果顯示：細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，3 d后克隆球開始形成，說明神經(jīng)干細(xì)胞的增殖特性。部分神經(jīng)球出現(xiàn)融合及貼壁分化現(xiàn)象，細(xì)胞呈典型 NSCs 形態(tài)。Nestin是一種屬于第Ⅵ類中間絲類型的蛋白，僅在胚胎早期神經(jīng)上皮表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)前體細(xì)胞向終末方向分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞時，Nestin 便停止表達(dá)，可以作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，常常應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)[21]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)巢蛋白染色鑒定，大部分為陽性細(xì)胞，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為海馬神經(jīng)干細(xì)胞，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

EGF已經(jīng)被證實(shí)是促進(jìn)NSCs增殖最為重要的影響因子[22]，可以維持干細(xì)胞的長期存活生長，促進(jìn) NSCs 進(jìn)行對稱性分裂，其產(chǎn)生的子代細(xì)胞均可繼續(xù)分裂。而B-27、bFGF 則起到維持細(xì)胞懸浮、抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用[23]。本實(shí)驗(yàn)所用的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基由B-27、bFGF、EGF等組成，可以維持干細(xì)胞的增殖，當(dāng)細(xì)胞聚集增多，不斷增殖、變大，干細(xì)胞球的體積也隨之增長，使干細(xì)胞神經(jīng)球內(nèi)層的細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸的表面積變小，營養(yǎng)物質(zhì)交換變少，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)凋亡，這與文獻(xiàn)報道一致[24]。有研究提示：高體積分?jǐn)?shù)血清能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，而低體積分?jǐn)?shù)血清有利于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[25]，本實(shí)驗(yàn)研究提示含藥血清會影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化，具體如何避免中藥含藥血清影響干細(xì)胞的貼壁及分化，并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元定向分化有待于課題組進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

本實(shí)驗(yàn)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中風(fēng)膏含藥血清對 OGD/R損傷后的大鼠海馬NSCs增殖能力有顯著的修復(fù)作用，說明體現(xiàn)“益氣活血法”的中風(fēng)膏可以促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)為將來中醫(yī)藥促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)神經(jīng)再生，治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其促增殖的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞死亡是腦缺血/再灌注損傷的最嚴(yán)重形式，腦缺血/再灌注后的凋亡機(jī)制參與細(xì)胞死亡。因此，尋求有效措施減少細(xì)胞凋亡已成為降低缺血/再灌注腦組織損傷的靶點(diǎn)之一[26]。本研究顯示，20%中風(fēng)膏含藥血清對干細(xì)胞損傷有治療作用，可降低細(xì)胞凋亡，這可能是中風(fēng)膏對神經(jīng)干細(xì)胞損傷治療的作用機(jī)制之一。培養(yǎng)體系或反應(yīng)體系中的含藥血清濃度愈高，則藥量愈大，所取含藥血清的體外藥理效應(yīng)就越強(qiáng)[27]，本實(shí)驗(yàn)為該推論提供確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。中藥血清藥理學(xué)研究為中藥復(fù)方的時效、量效關(guān)系規(guī)律的探索提供新的思路和方法，對于建立和完善中醫(yī)藥“病-證-方-量-時-效”理論體系和推動中醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展具有重要意義[28]。此外，關(guān)于中風(fēng)膏究竟是如何激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖與定向分化，抑制凋亡，揭示其神經(jīng)保護(hù)通路和神經(jīng)功能重建調(diào)節(jié)機(jī)制，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究。