李依琪， 李 樂

(1. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥劑13級(jí)， 2. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 杭州 310014)

心肌肥厚(cardiac hyoertrophy,CH)是心肌細(xì)胞對(duì)壓力或容量負(fù)荷的適應(yīng)性表現(xiàn)，顯示為心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化和電生理特性改變。被確認(rèn)是心衰、冠心病、猝死等的單獨(dú)高危因素，而其形成機(jī)制復(fù)雜，無特效治療藥物[1]。因此，有效防治CH的藥物研究有重要臨床價(jià)值。青藤堿(sinomenine，Sin)是來自中藥青風(fēng)藤的生物堿，臨床治療風(fēng)濕及抗心律失常。而且，藥理學(xué)研究顯示，Sin能改變心肌電生理特性，有抗炎作用，通過清除氧自由基與抗脂質(zhì)過氧化而對(duì)抗氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與CH發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無Sin對(duì)CH作用的研究。本實(shí)驗(yàn)利用異丙腎上腺素(isoprenaline,Iso)誘導(dǎo)小鼠建立CH模型，觀察Sin拮抗CH的作用及其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑

昆明種小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)：SCXK(浙)2015-0024。Sin，西安小草植物科技公司(XC20141120,純度≥98%)；鹽酸Iso注射液(上海禾木制藥有限公司，140906)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、蛋白定量試劑盒(南京建成研究所)。兔抗NF-κB抗體(美國(guó)Santa Cruz)，辣根過氧化酶山羊抗小鼠抗體IgG(美國(guó)cell signaling)。

1.2 主要儀器

RJ-酶標(biāo)儀(美國(guó)BD 公司)；722N分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)；KDC-2046低溫離心機(jī)(中科大創(chuàng)新股份有限公司)；Qwin圖像分析軟件(德國(guó)Leica)。

1.3 動(dòng)物分組、造模、 給藥

健康昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)均分為對(duì)照組、Iso模型組、Iso+Sin 50 mg/kg組、Iso+Sin 200 mg/kg組。除對(duì)照外，其余組小鼠均i.hIso，逐日一次，當(dāng)日劑量40 mg/kg，第2日20 mg/kg，第3日10 mg/kg，之后保持10 mg/kg，持續(xù)14 d。隨意進(jìn)食、飲水，創(chuàng)建CH模型，對(duì)照組每天i.h等量生理鹽水。 給藥和造模同時(shí)進(jìn)行，每日上午注射Iso 4 h后，分別給予Sin 50 mg/kg和200 mg/kg灌胃治療，逐日一次;對(duì)照組和模型組等量生理鹽水灌胃，持續(xù)4周。

1.4 心臟重量指數(shù)測(cè)定

小鼠末次用藥12 h后，稱體重(body weight, BW)，眼球取血處死取心臟，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱全心重(heart weight, HW)；分離左心室，稱左心室重量(left ventrical weight，LVW)，分別計(jì)算心重指數(shù)(HWI=HW/BW)和左心室重量指數(shù)(LVWI=LVW/BW)。另取心肌左室標(biāo)本， HE及Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.5 心肌組織SOD、MDA水平及血清LDH測(cè)定

小鼠眼球取血后于4℃，3 000 r/min，離心10 min，分離血清，按LDH試劑盒說明測(cè)定LDH活性；取小鼠心肌組織，制備勻漿，于4℃，2 000 r/min，離心10 min取上清液分別按試劑盒說明測(cè)定SOD和MDA水平。

1.6 心肌組織學(xué)觀察

左室心肌組織，4%甲醛過夜，酒精脫水石蠟包裹， HE及 Masson 染色，光學(xué)顯微鏡攝像(400倍)，Image-Pro Plus 5.0軟件隨機(jī)測(cè)定Masson染色切片視野中藍(lán)染部分，分析心肌纖維化面積。

1.7 免疫組化測(cè)定小鼠心肌NF-κB蛋白表達(dá)水平

石蠟切片脫蠟水化，3%雙氧水浸潤(rùn)20 min，羊血清孵化10 min，順次加NF-κB一抗,室溫60 min，山羊抗小鼠IgG二抗室溫30 min，鏈親和素-過氧化酶溶液室溫10 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片，顯微鏡觀察。Qwin圖像分析軟件對(duì)組織切片染色胞漿中陽性表達(dá)(棕黃色顆粒)進(jìn)行定量，測(cè)算鏡下光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠心臟質(zhì)量參數(shù)

與對(duì)照組比較，i.hIso后 ，Iso模型組小鼠HWI和LVWI增大,符合《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中CH模型標(biāo)準(zhǔn)，顯示CH構(gòu)建成功。Iso+Sin 50 mg/kg,200 mg/kg治療組，HWI和LVWI比Iso模型組有所減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 200 mg/kg Sin的作用更明顯(表1)。

GroupDose(mg/kg)HWI (mg/g)LVWI (mg/g)Control-3.21±0.142.27±0.17Iso model-3.89±0.34??2.95±0.23??Iso+Sin503.75±0.28#2.68±0.32#Iso+Sin2003.56±0.32##▲2.47±0.24##▲

HWI： Heart weight index； LVWI： Left ventricular weight index

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group;▲P<0.05vsIso+Sin 50 mg/kg group

2.2 小鼠血清LDH活性和CH組織中氧化損傷指標(biāo)

連續(xù)i.h Iso后，Iso模型組小鼠血清LDH活性、心肌組織MDA含量提高，T-SOD活性降低，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)；用Sin 50、200 mg/kg治療后，各治療組LDH、MDA較Iso模型組下降，T-SOD上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 200 mg/kg Sin的作用更明顯(表2)。

GroupDose(mg/kg)LDH(U/L)MDA (mmol/mg.prot)T-SOD(U/mg.prot)Control-396±4847±8184±76Iso model-729±82??86±12??51±18??Iso+Sin50563±67#63±11#83±25#Iso+Sin200431±56##$52±9##▲138±74##▲

LDH: Dehydrogenase; MDA: Malondialdehyde; T-SOD: Total-superoxide dismutase

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group;▲P<0.05vsIso+Sin 50 mg/kg group

2.3 心肌組織病理學(xué)

光鏡下，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列歸整、胞質(zhì)著色均勻。Iso模型組心肌細(xì)胞體積增大，胞核體積變大深染，細(xì)胞間藍(lán)染纖維化增多和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量Sin治療后，心肌細(xì)胞排列較齊整，細(xì)胞肥大減緩，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)纖維化減少(圖1)。

Fig.1Pathological changes of myocardial tissue in each group of mice(The upper figure HE staining, the lower figure Masson staining, ×100)

A: Control group; B: Isoprenaline(Iso)model group; C: Iso+sinomenine(Sin)50 mg/kg group; D: Iso+sin 200 mg/kg group

2.4 小鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)水平

圖2,圖3顯示，與對(duì)照組比較，模型組心肌NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差別有顯著性意義(P<0.05)。Sin治療后， NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，與模型組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig.2Changes in the expression of NF-κB protein in the myocardium of mice(×100)

A: Control group; B: Isoprenaline(Iso)model group; C: Iso+sinomenine(Sin)50 mg/kg group; D: Iso+sin 200 mg/kg group

Fig.3Changes in the expression of NF-κB protein in the myocardium of mice

A: Control group; B: Isoprenaline(Iso)model group; C: Iso+sinomenine(Sin)50 mg/kg group; D: Iso+sin 200 mg/kg group

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsIso model

3 討論

CH是很多心血管疾病共同的病理表現(xiàn)，其心肌中有嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，惡化心肌損傷，誘發(fā)心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭[3]。利用i.hIso致CH是常用的動(dòng)物造模方法，本實(shí)驗(yàn)i.hIso后4 周，HWI、LVWI、LW/BW顯著性增大，結(jié)合HE染色心肌細(xì)胞肥大，Masson 染色間質(zhì)纖維化顯著,提示Iso造CH模型成功。

氧化應(yīng)激是指活性氧( reactive oxygen species，ROS) 產(chǎn)生過多后導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。ROS是誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)，包括超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基等。ROS與多不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物是脂質(zhì)過氧化物，因此MDA 的含量可以反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的程度。SOD即超氧化物岐化酶，是人體對(duì)抗內(nèi)、外環(huán)境超氧離子損害的重要酶。MDA水平提高，SOD活性下降，即可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引發(fā)細(xì)胞損害甚至細(xì)胞死亡[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sin組能減弱Iso誘導(dǎo)的小鼠CH程度， 降低 HWI、LVWI比值。HE和 Masson 染色證明心肌細(xì)胞肥大程度減輕，間質(zhì)纖維化減少；提示Sin抑制心肌細(xì)胞肥大和纖維化；同時(shí)，Iso誘發(fā)的CH模型組小鼠，血清LDH水平、心肌MDA含量升高及心肌T-SOD活性降低；應(yīng)用Sin治療，可明顯降低血清LDH水平、心肌MDA含量、提高心肌T-SOD活性，表明Sin 能對(duì)抗氧化應(yīng)激，對(duì)心肌有保護(hù)作用。

CH時(shí)心肌局部有不少炎癥介質(zhì)被激活，如 NF-κB、TNF-α、IL-1β 等，核因子 NF-κB可刺激TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)，NF-κB/IκB信號(hào)通路激活，促進(jìn)心臟形成CH[5]。Sin通過抑制 NF-κB蛋白表達(dá)，減弱心肌中炎癥反應(yīng)及NF-κB/IκB信號(hào)通路活化，對(duì)抗CH。

綜上所述，Sin可能通過對(duì)抗 NF-κB蛋白表達(dá)、對(duì)抗氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化而起心肌保護(hù)作用，這為Sin將來臨床應(yīng)用防治CH提供新思路。