游 佳， 陳 薇， 鄭 琦， 陳 靖， 朱月永

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝病中心， 福州 350004)

免疫性肝損傷是由于藥物等相關(guān)因素觸發(fā)，導(dǎo)致肝組織內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 產(chǎn)生免疫炎癥應(yīng)答，從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝臟損傷，約占肝損傷疾病的20%[1]。免疫性肝損傷是導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末病變發(fā)生的重要因素，決定了肝臟疾病的轉(zhuǎn)歸和發(fā)生發(fā)展，嚴(yán)重危害人類健康[2]。然而，免疫性肝損傷的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，更缺乏特效的治療藥物，而其中，一種客觀規(guī)范、穩(wěn)定可靠、符合免疫性肝損傷臨床發(fā)病特點(diǎn)的動(dòng)物模型是研究該疾病的重要基礎(chǔ)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，目前應(yīng)用最為廣泛的免疫性肝損傷動(dòng)物模型主要包括以下3種藥物干預(yù)：刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)、α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide, α-Galcer)與脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)/D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-Gal N)，均能引起機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝組織損傷。NKT細(xì)胞(natural killer T cells)是一類既表達(dá)T細(xì)胞受體又表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志的一組異質(zhì)性淋巴細(xì)胞亞群，在先天固有性免疫和后天適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用，是目前免疫性損傷研究中的熱點(diǎn)。本研究擬以NKT細(xì)胞功能為切入點(diǎn)，探討其在Con A、α-Galcer與LPS/D-Gal N分別誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型小鼠中的變化特點(diǎn)，對(duì)于免疫性肝損傷的發(fā)病機(jī)制及保肝藥物篩選研究都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量22～26 g，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(閩)2016-0002]，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物房。購(gòu)入后先適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，期間自由飲水?dāng)z食。

1.2 試劑與主要儀器

Con A、α-Galcer、LPS/D-Gal N均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)兔抗鼠多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司；PE標(biāo)記的兔抗CD3、FITC標(biāo)記的鼠抗NKR-P1A購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；全自動(dòng)生化檢測(cè)儀購(gòu)自日本日立公司；MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；5417R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

40只小鼠隨機(jī)分為4組，包括空白對(duì)照組、Con A模型組、α-Galcer模型組和LPS/D-Gal N模型組，每組10只。參照文獻(xiàn)方法[5-7]分別對(duì)各模型組進(jìn)行造模，Con A模型組給予一次性尾靜脈注射ConA溶液(18 mg/kg)，α-Galcer模型組給予一次性腹腔注射α-Galcer溶液(40 μg/kg)，LPS/D-Gal N模型組分別給予一次性腹腔注射LPS溶液(10 μg/kg)和D-Gal N溶液(700 mg/kg)。造模完成后8 h，所有小鼠稱重，眼眶取血后脫頸處死，取肝臟稱重，計(jì)算肝指數(shù)(=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，然后部分肝組織保存于4%多聚甲醛溶液中用于病理檢測(cè)，部分肝組織于液氮中凍存待用。

1.4 血清ALT、AST水平檢測(cè)

取小鼠血液樣品，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清，生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清ALT、AST水平。

1.5 肝組織病理學(xué)檢測(cè)

取固定于4%多聚甲醛溶液中的小鼠肝組織，常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色(HE染色)后顯微鏡下觀察、拍片，分析各組動(dòng)物肝組織的病理?yè)p傷情況。

1.6 肝組織NKT細(xì)胞含量檢測(cè)

取小鼠肝組織，充分剪碎后收集，經(jīng)120目、100目重疊的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液于4℃、12 000 r/min條件下離心15 min；生理鹽水重懸，置于2 ml小鼠percoll淋巴細(xì)胞分離液中， 1 500 r/min離心10 min；收集交界面處的淋巴細(xì)胞層細(xì)胞，洗滌兩次，加入PE標(biāo)記的CD3和FITC標(biāo)記的NKR-P1A各10 μl，避光孵育1 h后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.7 肝組織TNF-α、IFN-γ、IL-6蛋白表達(dá)量檢測(cè)

取冷凍保存的小鼠肝組織，加入一定量RIPA裂解液，冰上勻漿后于4℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒法測(cè)定組織蛋白含量。按照Western blot實(shí)驗(yàn)步驟分別檢測(cè)小鼠肝組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6的蛋白表達(dá)量，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對(duì)應(yīng)灰度值的比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各模型小鼠肝指數(shù)及血清ALT、AST水平分析

與空白對(duì)照組比較，Con A組、α-Galcer組和LPS/D-Gal N組肝指數(shù)均顯著增加(P<0.01或P<0.05)，血清ALT、AST水平明顯異常升高(P<0.01)；各模型組之間肝指數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)，但ConA組血清ALT、AST水平較α-Galcer組有明顯升高(P<0.05，表1)。

GroupLiver indexALT(U/L)AST(U/L)Control 0.51±0.1195.6±10.536.4±5.4Con A 0.63±0.10?? 683.4±41.8??#483.5±51.6??#α-Galcer0.57±0.09? 572.4±63.5??378.9±42.0??LPS/D-Gal N 0.61±0.14?? 643.7±55.9??423.5±38.1??

Con A: Concanavalin A; α-Galcer: α-galactosylceramide; LPS/D-Gal N: Lipopolysaccharide/D-galactosamine; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsα-Galcer

2.2 各模型小鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)分析

空白對(duì)照組小鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，肝小葉、肝竇完整，細(xì)胞核大小一致，分布均勻；Con A組小鼠肝組織存在脂肪樣變性，細(xì)胞腫脹、排列較散亂，肝小葉缺失，肝竇內(nèi)有紅細(xì)胞淤積，部分區(qū)域可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；LPS/D-Gal N組小鼠肝組織細(xì)胞腫脹、排列較散亂，肝竇結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉不完整且存在點(diǎn)狀壞死情況；α-Galcer組小鼠肝組織細(xì)胞分布較均勻，細(xì)胞稍微腫脹，部分區(qū)域存在炎性浸潤(rùn)和壞死病灶，但面積明顯減少，損傷相對(duì)較輕。從病理結(jié)果分析，Con A組小鼠肝損傷最重，LPS/D-Gal N組次之，α-Galcer組則相對(duì)較輕(圖1，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

2.3 各模型小鼠肝組織NKT細(xì)胞含量分析

與空白對(duì)照組比較，各模型組小鼠肝組織NKT細(xì)胞含量均明顯上升(P<0.01或P<0.05)，并以ConA組和α-Galcer組上升最為顯著(P<0.01)；各模型組之間比較，ConA和α-Galcer組較LPS/D-Gal N組有明顯差異(P<0.05，圖2)。

Fig.2Analysis of NKT cell content in liver tissues of each group of mice (n=6)

*P<0.05；**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsLPS/D-Gal N

2.4 肝組織TNF-α、IFN-γ、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量分析

與空白對(duì)照組比較，各模型組小鼠肝組織炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)，其中LPS/D-Gal N組相對(duì)其余兩模型組炎性因子的表達(dá)上調(diào)最小，但組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖3)。

Fig.3Relative expressions of TNF-α, IFN-γ and IL-6 proteins in liver tissues of mice (n=4)

Con A: Concanavalin A; α-Galcer: α-galactosylceramide; LPS/D-Gal N: Lipopolysaccharide/D-galactosamine; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IFN-γ: Interferon-γ; IL-6: Interleukin-6

**P<0.01vscontrol

3 討論

肝損傷動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用對(duì)于肝臟疾病發(fā)病機(jī)制的研究及治療藥物的篩選有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前肝損傷動(dòng)物模型的造模方法很多，主要可分為四大類：化學(xué)性肝損傷模型、藥物性肝損傷模型、免疫性肝損傷模型和酒精性肝損傷模型[8]。其中，因免疫性肝損傷發(fā)病率逐年提高，其相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也備受關(guān)注，本研究以3種常用的免疫性肝損傷動(dòng)物模型為研究對(duì)象，通過(guò)比較研究NKT免疫細(xì)胞功能改變情況，旨在尋找一種在病理生理機(jī)制上更接近臨床發(fā)病特點(diǎn)的免疫性肝損傷動(dòng)物模型。

AST和ALT是反應(yīng)肝損害的敏感指標(biāo)，其升高程度在一定程度上能反映肝細(xì)胞受損程度，是目前臨床上肝功能檢測(cè)經(jīng)典指標(biāo)之一[9]。肝指數(shù)是肝臟重量占體重的比值，在表觀層面反映了肝臟的代謝功能及病變情況[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各模型組小鼠血清AST和ALT水平均顯著升高，肝功能受損；肝指數(shù)病理性增加，肝組織有病變發(fā)生。HE染色深入觀察肝組織病理情況發(fā)現(xiàn)，各模型組小鼠肝組織均存在不同程度的脂肪樣變性、胞體腫脹、排列散亂、炎性浸潤(rùn)和壞死病灶等病理現(xiàn)象。上述結(jié)果說(shuō)明，Con A、α-Galcer和LPS/D-Gal N誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠均存在肝功能受損及肝組織病變等情況，但其中α-Galcer組損傷相對(duì)較輕。

NKT細(xì)胞是免疫細(xì)胞中一類獨(dú)特的具有NK細(xì)胞特性的淋巴細(xì)胞，在肝臟中廣泛分布。作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，NKT細(xì)胞以“雙刃劍”的方式調(diào)節(jié)著免疫系統(tǒng)，一方面，通過(guò)識(shí)別CD1d抗原復(fù)合物而活化，發(fā)揮固有免疫作用，保護(hù)機(jī)體組織；另一方面，活化的NKT 細(xì)胞能快速分泌大量炎性細(xì)胞因子，造成局部炎性紊亂，損傷機(jī)體組織[11-12]。TNF-α、IFN-γ、IL-6是參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，其中，TNF-α是炎癥反應(yīng)過(guò)程中最重要的炎性介質(zhì)，直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織病理?yè)p傷；IL-6是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑，表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變性、壞死；IFN-γ則是活化并刺激免疫細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的激動(dòng)劑[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各模型組小鼠肝組織中NKT細(xì)胞含量較對(duì)照組顯著上升，炎性因子表達(dá)顯著升高，表明Con A、α-Galcer和LPS/D-Gal N都可能是通過(guò)激活NKT細(xì)胞介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫性肝損傷疾病的發(fā)生，但LPS/D-Gal N對(duì)NKT細(xì)胞的激活能力明顯低于Con A和α-Galcer。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Con A、α-Galcer和LPS/D-Gal N均能有效誘導(dǎo)免疫性肝損傷動(dòng)物模型，但不同造模方法在肝損傷程度及NKT細(xì)胞功能方面有一定差異；其中，Con A誘導(dǎo)的動(dòng)物模型肝臟病理?yè)p傷及免疫紊亂最為明顯，更符合疾病臨床特點(diǎn)，可作為免疫性肝損傷的首選模型。