陳建國， 江祺川， 溫 博， 王若雅， 吳亞更， 李 響

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院頭頸外科， 遼寧 錦州 121001)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常見的神經退行性疾病之一，以漸進性認知功能障礙和行為損害為特征[1]。雖然老年斑和神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)通常被認為是AD的標志，氧化應激和突觸功能障礙也與認知功能下降相關[2, 3]。β淀粉樣蛋白(amyloid protein，Aβ)來源于淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)淀粉樣變性過程，是AD病理生理學中老年斑的主要成分。Aβ在AD的發(fā)病機制中起著重要作用，并且在通過直接和間接的方式產生自由基的可溶性Aβ低聚物中發(fā)揮重要作用[4]。NFT由過度磷酸化的tau蛋白聚集成對螺旋狀細絲而形成。因此，抑制Aβ聚積和tau蛋白過度磷酸化已被認為是AD的治療策略。

因AD的病因及發(fā)病機制較為復雜，因此針對該疾病的動物模型的制備也多種多樣，主要包括自然衰老模型、Aβ 注射造模、D-半乳糖造模、轉基因模型、膽堿能系統(tǒng)損傷模型以及中毒損傷模型等，本研究所采用模型屬于多重復制模型，接近于自然衰老模型，且重現(xiàn)Aβ沉積的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化及神經原纖維纏結等AD經典病理變化，能較好地模擬 AD 的相關衰老的表型，具有操作簡單、價格低、重復性高等特點。

腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)對神經元的存活和神經突的生長具有重要作用，BDNF參與學習和記憶過程，AD患者的血清BDNF水平較正常受試者降低，同樣AD轉基因小鼠BDNF表達下調，證明BDNF在AD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5, 6]。BDNF通過活化其細胞膜上的TrkB受體發(fā)揮其生物學作用。

Deoxygedunin是一種新型的，高親和力的TrkB受體激動劑，模擬BDNF與TrkB結合，使TrkB受體發(fā)生自體磷酸化，進一步激活神經保護作用的分子通路而發(fā)揮生物學作用。Deoxygedunin具有抗氧化、抑制神經元死亡、改善學習記憶、改善抑郁和促進神經再生等作用。有研究顯示TrkB受體激動劑Deoxygedunin對1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四羥吡啶誘導的帕金森疾病模型的多巴胺能神經元具有保護作用[7]。但目前關于Deoxygedunin是否對神經退行性疾病AD具有神經保護作用，以及該神經保護作用是通過何種機制來發(fā)揮尚未有報道，因此本實驗通過評估Deoxygedunin對D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的阿爾茨海默病大鼠是否具有神經保護作用以及探討其機制，以期為AD的治療提供新的神經保護策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性SD大鼠購于北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，體重(250±20) g，SD大鼠許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級別，溫度為25℃晝夜循環(huán)交替。將大鼠分為3組(n=12)：對照組(Control)、模型組(AD)和干預組(AD+Deo)。模型組采用D-半乳糖180 mg/(kg·d)腹腔注射聯(lián)合AlCl315 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥12周，構建阿爾茨海默病大鼠模型；對照組腹腔注射和灌胃等體積生理鹽水；Deo組是在造模12周后，給予Deoxygedunin 5 mg/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)2周。

1.2 主要抗體、試劑和儀器

用于蛋白免疫印跡實驗的兔單克隆抗體Anti-Tau(磷酸化T231位點)、 TrkB/p-TrkB、AKT/p-AKT、ERK1/p-ERK1抗體均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自CST公司；Deoxygedunin購自Gaia公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)來自碧云天生物技術公司；AlCl3購自國藥集團化學試劑有限公司；Biotin-WO2來自德國Abeta有限公司；辣根過氧化物酶-親和素購自美國Pierce公司；TMP 微孔過氧化物酶系統(tǒng)購自美國Kirkegaard和Perry實驗室。

1.3 水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習記憶能力

Deo給藥結束前5 d行Morris水迷宮實驗。通過掛在泳池周圍的圖案訓練大鼠尋找隱匿平臺。將大鼠從不同象限放入泳池，記錄大鼠到達平臺的時間，即逃避潛伏期。若60 s內大鼠仍未到達平臺，將其引導到平臺上停留5 s，并將潛伏期記錄為60 s，每只大鼠接受連續(xù)6 d的訓練，4次/天(n=12)。第7日撤去水上平臺，固定入水點，記錄大鼠60 s內在目的象限內停留的時間、穿越平臺次數(shù)和游泳速度，用于評估大鼠學習和記憶能力。

1.4 ELISA實驗測量Aβ40和Aβ42蛋白的濃度

水迷宮實驗結束2 h后，取大鼠雙側新鮮海馬組織，采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)實驗定量分析各組大鼠海馬Aβ水平(n=4)。用特異性單克隆抗體結合樣品中的Aβ40和Aβ42蛋白，然后用Biotin-WO2抗體探測，然后用辣根過氧化物酶-親和素進行結合。使用TMP微孔過氧化物酶系統(tǒng)檢測辣根過氧化物酶活性。嚴格按 ELISA 試劑盒的操作規(guī)范進行試驗，所有標本和試劑盒使用前均提前0.5 h放在室溫平衡。

1.5 Western blot法檢測TrkB信號通路上ERK1、AKT和TrkB的蛋白表達

水迷宮結束后2 h處死大鼠取材，取雙側新鮮海馬置于勻漿液中進行組織勻漿(n=4)。使用BCA方法測量蛋白質濃度。將處理后的蛋白樣本通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質并轉移至PVDF膜。5% 脫脂奶粉封閉 2 h，一抗孵育 4℃ 過夜(TrkB/pTyr516-TrkB、Akt/pSer473-Akt、ERK1/p-ERK1稀釋比例為1∶10 000)。然后與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫避光溫育2 h，并用化學發(fā)光底物試劑盒顯色。使用ImageJ軟件對蛋白免疫印跡條帶進行掃描和分析。

1.6 免疫組織化學染色法檢測大鼠腦皮質Aβ1-40和Aβ1-42 蛋白表達情況

Morris水迷宮認知能力測試結束2 h后，大鼠行4%多聚甲醛心臟灌流取材，用4%多聚甲醛固定48 h，進行切片染色(n=4)。具體步驟如下：室溫脫蠟、水化；采用微波修復抗原；免疫組化筆畫圈；3%過氧化氫滅活內源酶活性；封閉非特異性位點；甩掉封閉液，滴加一抗Anti-Tau (磷酸化T231位點)覆蓋組織，然后放入濕盒內4℃過夜。(稀釋比例1∶200)；次日4℃冰箱取出濕盒，室溫復溫30 min，滴加二抗；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液；滴加DAB溶液；蘇木素復染。顯微鏡下觀察大腦皮質Aβ1-40和Aβ1-42 表達情況。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Deoxygedunin對D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的大鼠學習和記憶缺陷的影響

Morris水迷宮實驗用來測試大鼠的學習和記憶能力。與對照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加；與模型組相比，Deo干預組逃避潛伏期顯著降低，尤其是第7日降低最為明顯(表1)。與對照組相比，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)較少；與模型組相比，Deo干預組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著增多(表2)。所有各組大鼠的游泳速度沒有顯著差異(表2)。這些結果表明Deoxygedunin干預有效地恢復了D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的學習和記憶功能缺陷。

Tab.1 The latency of time to find platform of the three groups(s， n=12)

AD: Alzheimer's disease model group； AD+Deo: Alzheimer's disease model+deoxygedunin intervention group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

GroupNumber of crossings(n/s)Swimming speed(cm/s)Control4.40±0.9417.53±2.23AD2.17±0.92??16.03±1.83AD+Deo3.87±0.60##19.00±2.94

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

2.2 Deoxygedunin對D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的Aβ 積聚的影響

與對照組相比，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖聯(lián)合AlCl3的應用顯著增加海馬Aβ集聚；與模型組相比，Deoxygedunin應用會減少Aβ40和Aβ42的表達水平(表3)。

GroupAβ40Aβ42Control25.52±1.7110.50±1.29AD70.00±5.71??47.00±3.27??AD+Deo30.03±2.87##18.03±2.19##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

2.3 Deoxygedunin對D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的氧化應激反應的影響

通過測定海馬中MDA和GSH水平以及SOD活性來測定氧化應激。D-半乳糖聯(lián)合AlCl3處理可增加MDA水平，同時抑制GSH水平和SOD活性(表4)。Deoxygedunin可以恢復D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的這些效應。MDA代表脂質氧化，GSH-Px活性表明消除自由基的能力，Deoxygedunin可改善脂質氧化和清除自由基的能力。

GroupMDA(nmol/mg)GSH-Px(pg/mg)SOD(U/mg)Control0.91±0.129.98±1.393.90±0.75AD1.48±0.16??6.03±0.69??1.40±0.43??AD+Deo1.08±0.17#10.03±0.82 ##3.30±0.42##

AD: Alzheimer's disease model group； AD+Deo: Alzhei mer's disease model+deoxygedunin intervention group

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.4 Deoxygedunin對Tau蛋白過度磷酸化的影響

Tau蛋白在大腦皮質神經元內呈棕黃色陽性著色。對照組大鼠大腦皮質神經元胞膜上有少量淡黃色陽性顆粒。模型組大鼠腦皮質神經元胞膜染色呈棕黃色強陽性。Deo組大鼠腦皮質神經元胞膜含有弱陽性淺棕黃色顆粒(圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

2.5 Deoxygedunin對TrkB信號通路上ERK1、AKT和TrkB的蛋白表達的影響

BDNF/TrkB通路對突觸和神經元的可塑性均具有利作用。Deoxygedunin是一種新型TrkB激動劑，能起到神經保護作用。用Deoxygedunin干預的大鼠海馬中TrkB的磷酸化水平降低。BDNF/TrkB通路的重要下游分子TrkB，AKT和ERK1活性檢測結果顯示Deoxygedunin可逆轉被D-半乳糖聯(lián)合AlCl3抑制的TrkB信號轉導通路(圖2，表5)。

Fig.2The expressions of pTyr516-TrkB, pSer473-Akt and pERK1 protein detected with Western blot

GrouppTyr516-TrkB/TrkBpSer473-Akt/AktpERK1/ERK1Control1.00±0.111.00±0.231.00±0.19AD0.40±0.03?0.49±0.05?0.23±0.11?AD+Deo1.13±0.26#0.96±0.20#1.03±0.27 #

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

3 討論

AD發(fā)病機制極其復雜，其典型的病理特征是老年斑形成和神經纖維纏結。因此，改善Aβ毒性、抑制Aβ表達或抑制Tau蛋白過度磷酸化是防治AD的一個重要切入點[8, 9]。本研究的目的是探討黃酮類化合物Deoxygedunin在D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導AD樣病理改變所致功能障礙的保護作用。本研究通過D-半乳糖聯(lián)合AlCl3制備AD動物模型，其中D-半乳糖的代謝物因不能被機體代謝而堆積在細胞內，導致細胞代謝功能紊亂，產生氧化損傷，造成神經元結構和功能的變化而出現(xiàn)類似 AD 疾病的表型，AlCl3可刺激氧自由基產生，增強脂質過氧化，促使Aβ沉積、寡聚[10, 11]。因此，該模型可以作為篩選AD潛在的治療藥物的動物模型。本研究采用D-半乳糖180 mg/(kg·d)腹腔注射聯(lián)合AlCl315 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥12周，構建阿爾茨海默病大鼠模型。給藥12周后大鼠海馬組織內出現(xiàn)Aβ沉積和Tau蛋白表達過度增加，證實D-半乳糖聯(lián)合AlCl3可成功復制阿爾茨海默病大鼠模型。

有證據(jù)表明AD患者的BDNF-TrkB系統(tǒng)紊亂影響海馬依賴性記憶和認知功能障礙[12, 13]。BDNF通過活化其細胞膜上的TrkB受體發(fā)揮其生物學作用，但作為大分子的BDNF并不能穿過血腦屏障。因此，尋找小分子BDNF類似物是激活BDNF-TrkB通路發(fā)揮神經保護作用的關鍵所在Deoxygedunin是從印度苦楝樹中提取而來的一種黃酮類物質，具有抗氧化、抗腫瘤和改善學習記憶的作用[14]。Deoxygedunin是一種小分子BDNF的類似物，可通過血腦屏障，刺激BDNF表達并激活其特異性受體TrkB，被期望能發(fā)揮神經保護作用。

Aβ在AD中的神經毒性作用已被廣泛研究，包括損害突觸可塑性，誘導凋亡，促進Tau磷酸化和氧化應激。有研究表明，D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁可誘導小鼠腦組織內出現(xiàn)Aβ沉積和氧化應激等病理特征[15]。因此，本研究還檢測了Deoxygedunin干預后大鼠腦組織中Aβ沉積、Tau蛋白磷酸化和氧化應激的變化，結果發(fā)現(xiàn)Deoxygedunin可逆轉D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的Aβ積聚、Tau蛋白的過度磷酸化和氧化應激反應。本研究結果表明，Deoxygedunin可抵抗D-半乳糖和三氯化鋁神經毒性而發(fā)揮保護作用。

體內外研究還發(fā)現(xiàn)Deoxygedunin是一種較強的TrkB受體激動劑[16]，它可直接激活大腦TrkB受體，TrkB被激活后刺激信號轉導通路如PI3K/Akt，Akt是調節(jié)CREB活化的重要激酶，并且反過來又修飾學習和記憶所必需的分子表達。有研究顯示，AD轉基因小鼠大腦中Akt活性降低，表現(xiàn)為磷酸化水平下降[17, 18]。ERK是Tau蛋白磷酸化和細胞存活的重要激酶，它可因MEK/ERK信號轉導通路中TrkB的活化而被激活[19]。在先前的研究中已報道過Deoxygedunin的神經保護作用[7]，但大多數(shù)研究都集中在抑郁樣行為或改善學習記憶和認知功能[6]。本研究旨在探討Deoxygedunin對AD的神經保護作用。Western blot實驗顯示用Deoxygedunin干預的大鼠的海馬中，TrkB的磷酸化水平降低。我們進一步檢測了BDNF/TrkB通路的重要下游分子TrkB，AKT和ERK1的活性，結果發(fā)現(xiàn)Deoxygedunin可逆轉被D-半乳糖聯(lián)合AlCl3抑制的TrkB信號轉導通路。水迷宮結果也顯示，與模型組相比，Deo組大鼠尋找隱匿平臺的潛伏期顯著降低，穿越平臺的次數(shù)和目標象限停留的時間均顯著增多。本研究結果表明，補充模擬BDNF特異性作用的TrkB激動劑Deoxygedunin可體內激活TrkB，從而改善D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的認知功能障礙包括學習記憶障礙。

綜上所述，Deoxygedunin可改善D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的大鼠AD樣學習記憶障礙，增加腦組織SOD和GSH-Px的活性、降低腦組織MDA水平以及改善腦組織Aβ積聚和tau蛋白異常磷酸化。其具體作用機制可能是通過激活TrkB受體，提高下游信號通路的pTyr516-TrkB /TrkB、pSer473-Akt/Akt和pERK/ERK的磷酸化水平，激活TrkB信號通路。本研究提示Deoxygedunin可通過激活TrkB信號通路來發(fā)揮其神經保護作用，Deoxygedunin可作為潛在的AD靶向藥物，為AD防治提供了新策略，但向臨床轉化及應用仍需要大量的關于藥代動力學和生物利用度相關研究。