張妍樂(lè) 顧玲 馬志貴（通訊作者）

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川 成都 610000）

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphocyte leukemia，ALL）是臨床常見(jiàn)的血液惡性腫瘤，多發(fā)于幼兒群體，具有病情發(fā)展迅速、死亡率高等特點(diǎn)[1]。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）是ALL的主要治療手段之一，能特異性地調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)，阻滯惡性淋巴細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。但臨床數(shù)據(jù)[2]顯示，目前有超過(guò)1/4的兒童ALL患者在治療過(guò)程中出現(xiàn)GC耐藥性，影響其治療。微小RNA（microRNA,miRNA）是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)，被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究以人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株CEM-C7為研究對(duì)象，分析地塞米松誘導(dǎo)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞耐藥性和miR-15b之間的關(guān)系?，F(xiàn)具體報(bào)告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

CEM-C7為人急性T淋巴細(xì)胞白血病GC敏感細(xì)胞株，由美國(guó)E.Brad Thompson教授（University of Texas Medical Branch）提供，胎牛血清購(gòu)自Hyclon公司、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司、Trizol購(gòu)自Invitrogen公司、SYBR Green熒光定量qPCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，地塞米松購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.2 方法

取含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)、傳代CEM-C7細(xì)胞。取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整成2×105/ml的細(xì)胞懸液20ml。將細(xì)胞懸液充分混勻后隨機(jī)分為10ml每培養(yǎng)瓶?jī)山M，1組加入10nmol/L地塞米松，誘導(dǎo)72h后獲得CEM-C7耐藥性細(xì)胞株CEM-C7R。另一組加入等體積無(wú)水乙醇，常規(guī)培養(yǎng)72h。

之后，CEM-C7R細(xì)胞株停用地塞米松，CEM-C7細(xì)胞株繼續(xù)使用無(wú)水乙醇，兩組細(xì)胞株均傳代培養(yǎng)4、8、16、24周。之后均給與10nmol/L地塞米松處理，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，比較兩組細(xì)胞系的相對(duì)存活率。并于培養(yǎng)72h后采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)微小基因miR-15在兩組細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞系的耐藥性檢測(cè)

停用地塞米松誘導(dǎo)后，檢測(cè)兩組細(xì)胞的GC敏感性。傳代培養(yǎng)1、2、4、6個(gè)月時(shí)， CEM-C7R 細(xì)胞組的細(xì)胞存活率均高于CEM-C7細(xì)胞組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞系的耐藥性檢測(cè)

2.2 兩組細(xì)胞系中miR-15b的相對(duì)表達(dá)水平

相對(duì)于CEM-C7細(xì)胞中miR-15b的相對(duì)表達(dá)水平，CEM-C7R細(xì)胞中miR-15b的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組細(xì)胞系中miR-15b的相對(duì)表達(dá)水平

3.討論

GC是目前臨床治療ALL腫瘤一線藥物，具有療效顯著、安全性高等特點(diǎn)。但實(shí)際應(yīng)用中，部分ALL患者可能出現(xiàn)GC耐藥性，影響治療效果。本研究中，以CEM-C7細(xì)胞株為樣本，給予10nmol/L地塞米松誘導(dǎo)72h處理，獲得CEM-C7耐藥性細(xì)胞株CEM-C7R。之后對(duì)兩組細(xì)胞株進(jìn)行去地塞米松培養(yǎng)1、2、4、8個(gè)月。顯示傳代培養(yǎng)1、2、4、6個(gè)月時(shí)，CEM-C7R細(xì)胞組的細(xì)胞存活率均高于CEM-C7細(xì)胞組（P＜0.05）?？芍?jīng)地塞米松處理后，研究獲得耐藥性細(xì)胞株CEM-C7R，CEM-C7R細(xì)胞株對(duì)地塞米松不敏感。

MiRNA是近年來(lái)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，可感染RNA的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、轉(zhuǎn)移等等[3]。miR-15作為近年來(lái)被廣泛研究的MiRNA，屬于miR-15/16家族，主要影響細(xì)胞的增殖、凋亡以及侵襲等活動(dòng)。Liang[4]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-15/16參與調(diào)節(jié)ALL患者的GC敏感性。本研究中，分析兩組細(xì)胞株中miR-15的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示CEM-C7R細(xì)胞中miR-15b的相對(duì)表達(dá)水平與CEM-C7相比明顯降低（P＜0.05），證實(shí)miR-15b可能參與了急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞GC耐藥的獲得，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，CEM-C7 經(jīng)長(zhǎng)期低劑量地塞米松處理后可獲得GC耐藥性，其機(jī)制可能與miR-15b有關(guān)。

[1]王慧敏，歐陽(yáng)涓，滕軍旗，等.地塞米松誘導(dǎo)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞耐藥及對(duì)miR-15b表達(dá)的影響[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016，16(6):695-698.

[2]王秀月，黨學(xué)娟，汪湄，等.微小RNA在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2016，56(43):111-114.

[3]張金燕，張桔順，許貞書(shū)，等.Notch基因在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的表達(dá)和介導(dǎo)抗凋亡、耐藥機(jī)制的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23(4):919-924.

[4]Liangju C,Ming Y,Yan C,et al.Roles of miR-15b in endothelialcell function and their relevance to vascular diseases[J].YiChuan,2015,37(2):121-127.