杜旺，湯銅，錢(qián)波，李佳，鄭璐，童婷婷

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230601)

乳腺癌是全球女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的首要原因。全球癌癥數(shù)據(jù)顯示,2012年新發(fā)乳腺癌病例約170萬(wàn)，死亡病例約52萬(wàn)，新增病例和死亡病例分別占據(jù)全球女性癌癥的25%和15%[1]。在中國(guó)情況同樣嚴(yán)重，2016年全國(guó)腫瘤登記中心最新發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌發(fā)病率和病死率分別占女性惡性腫瘤第1位和第6位[2]。乳腺癌病因相當(dāng)復(fù)雜，與遺傳因素、激素、免疫及各種環(huán)境因素有關(guān)。隨著人們對(duì)乳腺癌發(fā)病相關(guān)基因和分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的加深，許多引起細(xì)胞增殖或抑制凋亡的分子已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[3]，其中有些可能成為推測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的候選標(biāo)志物[4]。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，RASSF1A基因已經(jīng)被廣泛研究。多項(xiàng)研究表明，RASSF1A幾乎在全身正常組織器官中均表達(dá)，而在多種實(shí)體腫瘤中存在表達(dá)缺失[5]。本文旨在研究RASSF1A在乳腺癌以及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義，探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科2015年3月—2016年3月經(jīng)病理確診的60例乳腺癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織。其中女性59例，男性1例，年齡34～74歲，中位年齡48歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行新輔助化療或放療。標(biāo)本離體后即用福爾馬林浸泡固定備用。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 臨床和病理資料 根據(jù)所取標(biāo)本對(duì)應(yīng)住院號(hào)，在患者病歷檔案中提取所需各項(xiàng)臨床、病理及影像資料，包括患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、脈管侵犯情況、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)、Ki-67 、TMN分期等資料。

1.3 試劑材料 RASSF1A單克隆抗體(Cat# ab23950 Abcam)購(gòu)自Abcam公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；石蠟切片制作所需材料試劑由安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。

1.4 制作石蠟切片、免疫組化染色及判定 將“1.1”項(xiàng)目中所固定好的標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片制成石蠟切片。按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色步驟，并應(yīng)用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

RASSF1A蛋白定位于胞質(zhì)內(nèi)，以棕色、棕褐色、黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，選取不重復(fù)的5個(gè)視野，按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：小于等于總數(shù)的10%計(jì)為1分；在>10%～50%之間計(jì)為2分；>50%計(jì)為3分。染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分相乘，1 分計(jì)為陰性“-”；2～4 分計(jì)陽(yáng)性“+”；≥ 6分計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法等進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1A在乳腺癌及癌旁組織表達(dá)情況 RASSF1A蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以棕色、黃色、棕褐色顆粒沉淀為陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1)。經(jīng)觀察分析，在60例乳腺癌組織中，有21例呈陽(yáng)性表達(dá)，而在60例癌旁組織中52例呈陽(yáng)性表達(dá)。RASSF1A 蛋白在癌旁組織表達(dá)陽(yáng)性率高于癌組織(P<0.05)。

2.2 RASSF1A在乳腺癌組織中表達(dá)與相關(guān)臨床病理資料相關(guān)性分析 所收集60例乳腺癌臨床標(biāo)本中，有21例RASSF1A表達(dá)陽(yáng)性。經(jīng)分析，RASSF1A蛋白的表達(dá)情況與性別、年齡、腫瘤最大直徑、ER、PR狀態(tài)無(wú)相關(guān)性(P>0.05),而與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、脈管侵犯、HER-2、Ki-67有相關(guān)性(P<0.05)。其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RASSF1A表達(dá)陽(yáng)性率為60.0%(12/20)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RASSF1A表達(dá)陽(yáng)性率為22.5%(9/40)；組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)者表達(dá)陽(yáng)性率為72.7%(8/11)，組織學(xué)分級(jí)Ⅱ級(jí)者表達(dá)陽(yáng)性率為35.5%(11/31)，組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)者表達(dá)陽(yáng)性率為11.1%(2/18)；有脈管侵犯者表達(dá)陽(yáng)性率為18.2%(4/22)，無(wú)脈管侵犯侵犯者表達(dá)陽(yáng)性率為44.7%(17/38)；HER-2擴(kuò)增者陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%(5/30),HER-2未擴(kuò)增者陽(yáng)性表達(dá)率為56%(14/25)。Ki-67表達(dá)≤14%者陽(yáng)性表達(dá)率為54.17%(13/24),Ki-67表達(dá)>14%者陽(yáng)性表達(dá)率為22.2%(8/36)。其中HER-2狀態(tài)檢測(cè)首先經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)，評(píng)分“0”或者“1+”的為HER-2陰性；評(píng)分“2+”者為交界性，需要進(jìn)一步檢測(cè)；評(píng)分“3+”為HER-2陽(yáng)性。所收集60例臨床病例中，HER-2評(píng)分為“2+”的患者有5例未選擇進(jìn)一步做FISH檢測(cè)。相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 RASSF1A在乳腺癌組織中表達(dá)與TMN分期相關(guān)性分析 經(jīng)過(guò)提取病案資料分析，TMN分期為局部早期(Ⅰ期、Ⅱ期以及部分ⅢA期(T3N1MO))的患者有31例，其中RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為48.4%(15/31)。TMN分期為局部晚期[Ⅲ期(除T3N1MO外)、Ⅳ期]的患者有29例，其中RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為20.7%(6/29)，乳腺癌局部早期患者中RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于局部晚期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.053,P=0.025)。

注:A.乳腺癌組織中RASSF1A蛋白表達(dá)陰性；B.癌旁組織中RASSF1A蛋白表達(dá)陽(yáng)性；C.乳腺癌組織中RASSF1A蛋白表達(dá)陽(yáng)性；D.癌旁組織中RASSF1A蛋白表達(dá)陰性。

圖1 免疫組化檢測(cè)RASSF1A在乳腺癌及癌旁組織表達(dá)情況(×200) 表1 60例患者臨床病理資料的相關(guān)性分析

注：各組織學(xué)分級(jí)之間采用χ2檢驗(yàn)的多重比較。

3 討論

RASSF1A基因是2000年Dammann等[6]在研究肺癌時(shí)通過(guò)酵母雙雜交篩選法首次發(fā)現(xiàn)其位于人類(lèi)3號(hào)染色體短棒2區(qū)第1條帶第2亞帶(3p21.3)上。RASSF1A基因是RASSF中的一員。RASSF包含了10個(gè)成員，分別是RASSF1～10[7]。其中RASSF1～6擁有C端Ras相關(guān)區(qū)域，而RASSF7-10則包含了N端Ras相關(guān)區(qū)域[8]。其中，RASSF1基因包含8個(gè)外顯子(1α、1β、2αβ、2γ、3、4、5和6)。通過(guò)不同啟動(dòng)子利用和可變剪接，RASSF1基因在人體中可以產(chǎn)生7種轉(zhuǎn)錄本(RASSF1A-G)，目前研究最多的是RASSF1A和RASSF1C。RASSF1A由外顯子1α、2αβ、3、4、5、6編碼，其中外顯子3、4、5、6編碼Ras相關(guān)區(qū)域[5，7]。RASSF1A的cDNA全長(zhǎng)1873bp，其包含的開(kāi)放閱讀框架(ORF)編碼一個(gè)分子量為38.8kD含有340個(gè)氨基酸的蛋白多肽[6]。RASSF1A蛋白含有多個(gè)重要的區(qū)域，從N端到C端分別為SH3結(jié)合區(qū)域、C1/DAG結(jié)合域即蛋白激酶C保守區(qū)1、ATM激酶磷酸化位點(diǎn)、Ras相關(guān)區(qū)域和一個(gè)SARAH序列[9]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A所包含的幾個(gè)特定區(qū)域可能對(duì)其作為抑癌基因具有重要作用[10-13]。

研究發(fā)現(xiàn)RASSF1A在多種人體腫瘤中存在表達(dá)缺失，而其表達(dá)缺失的主要原因是啟動(dòng)子CPG島甲基化[14-17]。作為一種抑癌基因，其缺失表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。本研究中，通過(guò)對(duì)乳腺癌及癌旁組織中RASSF1A表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的RASSF1A表達(dá)陽(yáng)性率為35%(21/60)，而在癌旁組織中表達(dá)陽(yáng)性率86.7%(52/60)，癌旁組織中RASSF1A 蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌組織(P<0.05)，也證實(shí)RASSF1A的缺失表達(dá)可能參與腫瘤的發(fā)生過(guò)程。

有關(guān)RASSF1A的研究非常廣泛，但有關(guān)其抑癌具體機(jī)制目前尚未完全明確。目前主要觀點(diǎn)認(rèn)為有促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及促進(jìn)微管穩(wěn)定性三種作用機(jī)制及途徑[9]。Dammann等[6]首次發(fā)現(xiàn)RASSF1A時(shí)，便指出使肺癌細(xì)胞重新表達(dá)RASSF1A基因可抑制其集落形成、非錨定生長(zhǎng)以及裸鼠成瘤的能力。研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和降低腫瘤細(xì)胞的致瘤性[19]。 除了發(fā)現(xiàn)RASSF1A 蛋白在癌組織和癌旁組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究也發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中RASSF1A表達(dá)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)脈管侵犯、HER-2狀態(tài)、Ki-67有相關(guān)性(P<0.05)。并且，TMN分期為早期[Ⅰ期、Ⅱ期以及部分ⅢA期(T3N1MO)]的患者RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為48.4%(15/31)。TMN分期為晚期[Ⅲ期(除T3N1MO外)、Ⅳ期]RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為20.7%(6/29)(P<0.05)。這也是提示著，RASSF1A在乳腺癌的發(fā)展過(guò)程中可能有重要作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了RASSF1A作為一種候選抑癌基因的可行性。其在乳腺癌組織中低表達(dá)，而在癌旁組織高表達(dá)。有關(guān)臨床、病理及影像資料與RASSF1A表達(dá)的相關(guān)性分析提示，RASSF1A可以作為一種潛在的乳腺癌臨床預(yù)后判斷指標(biāo)。

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