王雪梅，周松林，熊國亮

(江西省胸科醫(yī)院內(nèi)科，江西 南昌 330006)

胸腔積液是臨床常見的病癥，是結(jié)核性與惡性滲出性胸腔積液的主要原因。我國結(jié)核病發(fā)病率高，結(jié)核性胸腔積液是最常見的肺外結(jié)核[1-2]，胸腔積液結(jié)核桿菌培養(yǎng)或涂片使結(jié)核性胸腔積液的診斷與鑒別診斷比較困難,檢測抗酸桿菌的陽性率偏低[3-4]?？乖囵B(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)是結(jié)核分枝桿菌感染早期分泌的蛋白，為致病型結(jié)核分枝桿菌特有，可作為活動性結(jié)核的標志物，在非致病分枝桿菌及卡介苗(BCG)中缺失[5]，檢測CFP10能避免因感染非致病分枝桿菌或者卡介苗而出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象[6]。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)具有高靈敏度、可定量等特點，可作為一種免疫學(xué)檢查方法，其線性范圍寬、成本低、穩(wěn)定性強[7]。目前國內(nèi)尚未有診斷結(jié)核性胸腔積液采用TRFIA測定CFP10的相關(guān)報道，本研究旨在建立該檢測方法，為結(jié)核性胸腔積液的早期診斷提供技術(shù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月—2016年6月在江西省胸科醫(yī)院住院的結(jié)核性胸腔積液106例患者為觀察組，其中男性80例，女性26例，年齡16～85歲，平均年齡(55.04±19.48)歲。另選擇同期住院的非結(jié)核性胸腔積液40例患者為對照組，包括18例癌性胸腔積液和22例其他感染性胸腔積液。其中男性27例，女性13例，年齡15～84歲，平均年齡(58.70±18.02)歲。兩組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入和排除標準 納入標準：觀察組胸膜活檢可見結(jié)核結(jié)節(jié)；表現(xiàn)有盜汗、食欲下降、發(fā)熱、全身乏力等結(jié)核病癥狀；經(jīng)抗結(jié)核治療后癥狀緩解；純化蛋白衍生物試驗結(jié)節(jié)大于1.5 cm×1.5 cm；符合胸腔積液Light 標準對滲出性胸腔積液的判斷，胸腔積液細胞學(xué)檢測主要為淋巴細胞。術(shù)前均未接受抗結(jié)核治療。本研究獲醫(yī)院倫理評審委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。排除標準：患有惡性腫瘤、嚴重肝腎臟器病變、合并急慢性炎性感染疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病。

1.3 儀器與試劑 全自動時間分辨熒光免疫分析儀(1235 Auto DELFIA，美國Perkin Elmer 公司)，全自動酶聯(lián)免疫分析儀(Wellscan MK2，芬蘭Denley Dragon公司)，發(fā)光增強液(美國Perkin Elmer 公司)，Sephacryl S200柱(美國GE公司)，Eu3+標記試劑盒及CFP10單克隆抗體由杭州啟泰生物技術(shù)有限公司提供，結(jié)核分枝桿菌CFP10 ELISA試劑盒及結(jié)核抗體試劑由上海雙贏生物有限公司提供，牛血清白蛋白(BSA)由上海生物制品研究所提供?；颊呷朐汉笤谥委熐熬槿⌒厍环e液20 mL，并采集空腹靜脈血5 mL用于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，-20 ℃保存。

1.4 研究方法

1.4.1 固相包被抗體制備 用50 mmol·L-1pH=9.6的碳酸鹽緩沖液將CFP10單克隆抗體稀釋至濃度為5 μg·L-1，然后于96孔微孔板每孔中加入200 μL，4 ℃保存過夜，將包被液傾去并洗滌1次，采用去金屬離子的1%牛血清白蛋白(BSA)加磷酸鹽吐溫緩沖液于37 ℃封閉2 h。棄去封閉液，洗滌后真空抽干，于-20 ℃冷凍保存。

1.4.2 Eu3+標記抗體制備 將Eu3+-DTTA用超純水復(fù)融并配制成5 g·L-1濃度的Eu3+-DTTA溶液；將CFP10單克隆抗體于0.2 mol·L-1pH=9.5的強有力的化學(xué)結(jié)合力(CBS)內(nèi)透析24 h，以1∶3的比例將Eu3+-DTTA溶液在攪拌條件下加入透析好的抗體內(nèi)，振蕩25 min后避光靜置于4 ℃環(huán)境下標記48 h。過Sephacryl S200柱分離，洗脫液以50 mmol·L-1pH=7.8的Tris-HCl緩沖液，確定蛋白含量，合并第1峰各管，同時以Eu3+標記試劑盒檢測合并峰管的Eu3+濃度。標記率測定后稀釋分裝并凍干保存。

1.4.3 參考標準品的設(shè)置 將CFP10蛋白0.4 mL相繼等倍稀釋直到確定臨界點，通過對數(shù)曲線確定線性范圍為2.5～1 800 μg·L-1，最終確定5個標準品，將CFP10配制為濃度分別為2.5、25、100、500、1 800 μg·L-1的標準溶液，按每瓶1 mL 分裝后凍干，于-20 ℃冷凍保存。

1.4.4 TRFIA法檢測CFP10抗原 采用雙抗體夾心法，將100 μL標準品或胸腔積液標本加入包被了CFP10蛋白單克隆抗體的微孔中，20 ℃振蕩孵育1 h，洗滌3次后，加入用分析緩沖液進行1∶100稀釋的Eu3+-抗CFP10蛋白單克隆抗體100 μL，20 ℃振蕩孵育1 h，洗滌5次。滴入增強液100 μL，振蕩10 min，于熒光檢測儀上測定熒光值，最后依據(jù)標準曲線計算出標本中CFP10蛋白的含量。

1.4.5 Eu3+標記抗體標記率測定 將做好標記的抗體原液在紫外分光光度計上測吸光度OD值，以280 nm為標準，OD值為0.51。采用增強液將標記原液稀釋后測定熒光值，參考試劑盒提供的標準品。

2 結(jié)果

2.1 回收率比較 取含量為116.5 μg·L-1CFP10蛋白的胸腔積液依次加入濃度為25、100、500 μg·L-1的標準參考品中進行回收試驗，回收率分別為96.84%、96.32%、97.45%，平均回收率為96.87%。

2.2 劑量-反應(yīng)曲線 CFP10抗原-TRFIA劑量-反應(yīng)曲線的標準低點與標準高點的熒光計數(shù)相差大于2個數(shù)量級，熒光計數(shù)值與被測物的含量成算術(shù)級數(shù)正比例關(guān)系，曲線擬合相關(guān)系數(shù)r2=0.998，見圖1。

圖1 CFP10抗原的TRFIA標準曲線

2.3 精確度 TRFIA法的平均批內(nèi)CV與平均批間CV分別為2.98%及4.20%，分別優(yōu)于ELISA法的6.27%及7.74%，且TRFIA法不同濃度的批內(nèi)CV與批間CF均低于ELISA法的相應(yīng)濃度值，見表1。

表1 TRIFA與ELISA的精確度比較(n=25)

2.4 靈敏度 以濃度不同的CFP10蛋白(2.5、5、10、25、50、100、500 μg·L-1)進行檢測，TRFIA法的最低檢出濃度為2.5 μg·L-1，而ELISA法的最低檢出濃度為25 μg·L-1。取檢測熒光值較高的1例結(jié)核性胸腔積液患者的胸腔積液標本，倍比稀釋至1∶32 768，同時用ELISA法與TRFIA法檢測CFP10蛋白抗原，TRFIA法在1∶16 384結(jié)果仍為陽性，有檢測出抗原；而ELISA法的結(jié)果在1∶4 096時已為陰性。

2.5 TRFIA法臨界值 TRFIA法檢測觀察組CFP10的Log濃度為(1.924±0.57) μg·L-1，對照組的Log濃度為(0.108±0.03) μg·L-1，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.72，P<0.01)。對觀察組繪制ROC曲線，曲線下面積(AUC)為0.923，見圖2。取臨界值為11.86 μg·L-1時，靈敏度與特異度分別為95.28%與92.50%，總一致率為94.52%；陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值分別為97.12%和88.10%。ELISA法以29.52 μg·L-1為臨界值時，靈敏度與特異度分別為86.79%和85.00%，低于TRFIA法。具體數(shù)據(jù)見表2。

圖2 TRFIA法靈敏度與特異度

檢測方法結(jié)果確診結(jié)果/例(%)陽性陰性合計TRFIA陽性101(95.28)3(7.50)104陰性5(4.72)37(92.50)42ELISA陽性92(86.79)6(15.00)98陰性14(13.21)34(85.00)48合計10640146

3 討論

胸腔積液是指由胸膜、肺臟以及肺外疾病引起的過多液體積聚在胸膜腔內(nèi)[8]，胸腔積液可由多種因素導(dǎo)致，目前臨床最為常見的是結(jié)核性與惡性胸腔積液。結(jié)核性胸腔積液是引起滲出性胸腔積液的重要病因，作為結(jié)核病的高發(fā)地區(qū)，本病的治療亟待解決。在胸腔積液的發(fā)展過程中，多種因素在其中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)與介導(dǎo)作用，結(jié)核性與惡性胸腔積液中的差異尤其顯著，因此可以根據(jù)其鑒別胸腔積液性質(zhì)。結(jié)核性分枝桿菌CFP-10是自結(jié)核分枝桿菌的早期培養(yǎng)濾液中，可產(chǎn)生多種分泌性蛋白，是一種低分子量蛋白質(zhì)[9]。其能編碼產(chǎn)生CFP10這一特異性培養(yǎng)濾液蛋白，具有RD1特異性基因序列[10-11]，該區(qū)僅存在于極少數(shù)致病性分枝桿菌內(nèi)，包括蘇爾加分枝、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、堪薩斯分枝桿菌等，并不是所有的致病性分枝桿菌與卡介苗都都特異性地缺失RD1序列[12]，具有良好的抗原性，外周血單個核細胞產(chǎn)生γ-干擾素(IFN-γ)及發(fā)生增殖反應(yīng)，作為特異性抗原誘導(dǎo)結(jié)核菌素試驗(PPD)皮膚試驗陽性者的良好指示劑。感染結(jié)核分枝桿菌后，并不是馬上存在結(jié)核抗原，而需要一定的時間，一般感染8周后才逐漸出現(xiàn)，因此檢測快速診斷結(jié)核性胸腔積液的有效方法是對胸腔積液中的結(jié)核性分枝桿菌所分泌特異性抗原，結(jié)核感染的診斷研究中以CFP-10為目標抗原檢測為重要指標不斷受到關(guān)注[13-14]。

TRFIA是一種超微量的免疫分析檢測方法，采用具有獨特?zé)晒馓攸c的鑭系元素離子及其螯合物標記抗原或抗體。由于能達到原子水平標記，對標記物的影響非常低，因此其靈敏度非常高，極大程度減少了非特異性結(jié)合[15]。TRFIA的特異性熒光的衰變時間非常長，是傳統(tǒng)熒光的103～106倍，由于其具有獨特的熒光特性，TRFIA法與現(xiàn)有的放免法、化學(xué)發(fā)光法等臨床常用檢測相比，具有靈敏度高、操作簡易、重復(fù)性好、標準曲線范圍寬、標記物穩(wěn)定、沒有放射性污染、不被樣本自然熒光干擾等特點與優(yōu)勢。對于相同批次檢測的試劑，由于TRFIA有著穩(wěn)定性，可使用兩點定標或通過設(shè)定參考曲線標記，大大降低了檢測成本，提高了檢測效率。

本研究結(jié)核性胸腔積液應(yīng)用TRFIA方法檢測CFP10蛋白抗原含量，檢測范圍遠較ELISA法寬，最低檢出濃度僅為2.5 μg·L-1。靈敏度達到滿意的水準， 是良好的定量診斷試劑。本研究顯示TRFIA法的靈敏度95.28%與特異度92.50 %，均高于ELISA方法檢測值，與李新玲等[6]研究結(jié)果比較一致?？傇\斷一致率可高達94.52%，說明TRFIA法對結(jié)核性胸腔積液能獲得滿意的診斷效果，檢測CFP10抗原具有非常高的準確性。ROC曲線不受發(fā)病率與診斷界值的影響，作為一種經(jīng)典的診斷試驗評價曲線，它綜合反映了特異性、敏感性，曲線隨診斷界值變化的動態(tài)改變，診斷價值高時AUC應(yīng)大于0.9，其價值可根據(jù)AUC的大小來評價。通過分析得出ROC曲線AUC為0.923，提示結(jié)核性胸腔積液采用TRFIA法可獲得較高的診斷價值。

綜上所述，胸腔積液中采用TRFIA法測定CFP10蛋白含量，可提高結(jié)核性胸腔積液的診斷效率，具有早期診斷優(yōu)勢，且優(yōu)勢表現(xiàn)為靈敏度高、特異性強，對于鑒別惡性胸腔積液、結(jié)核性有著重要的價值，值得進一步深入探討與應(yīng)用推廣。

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