王玲，管淑玉，梁穎

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006)

到手香(ColeusamboinicusLour.)，別名左手香、印度薄荷，得此名因用手觸摸該植物葉片后，手指間會(huì)留下濃烈的香氣。到手香為唇形科鞘蕊花屬植物，原產(chǎn)于印度和東南亞；廣泛分布于南部非洲、南美洲，在國外作為一種香料，同時(shí)作為藥用植物和殺蟲劑、殺菌劑應(yīng)用，該植物在廣東潮汕地區(qū)民間偶有種植，當(dāng)?shù)厝擞盟鼇碇委熀硗磁c咳嗽。聯(lián)合國糧農(nóng)組織1999年農(nóng)業(yè)服務(wù)公告137號(hào)公布的《用作谷物殺蟲劑的香料與藥用植物》中列舉了世界上100余種具有殺蟲與殺菌活性的植物和植物精油，到手香列入其中[1]，國內(nèi)的中藥典籍和植物志、植物名錄均未收錄。到手香繁殖采用扦插法，春秋季為適宜期，生長迅速，全草功效為清涼、消炎、祛風(fēng)、解毒。當(dāng)前未查到有報(bào)道到手香水提液的鎮(zhèn)咳祛痰作用，而在廣東潮汕地區(qū)人們將到手香生鮮嫩葉洗凈后口銜用來治咳嗽，因此對(duì)到手香水提液進(jìn)行鎮(zhèn)咳祛痰藥效學(xué)研究很有意義。本文對(duì)到手香水提液進(jìn)行鎮(zhèn)咳祛痰作用研究，為到手香進(jìn)一步的開發(fā)利用提供有力的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 到手香：引種于廣東省陽江市陽西縣中山大學(xué)(原中山醫(yī)科大學(xué))藥材基地，在中山大學(xué)南校區(qū)校內(nèi)繁殖，由中山大學(xué)測(cè)試中心夏鋒高級(jí)工程師與生命科學(xué)院葉創(chuàng)興教授共同鑒定為到手香。濃氨水(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20150612)，美沙芬片(廣州光華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)T23004)，苯酚紅(廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)150904)，痰咳凈(廣州羊城藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)150315)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NIH小鼠，普通級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，由廣東省衛(wèi)生廳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：粵檢證字第2015A022號(hào)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 到手香水提液的制備 取到手香植物地上部分，晾干，剪碎，精密稱取碎葉適量， 加入10倍量蒸餾水浸泡2 h，90～100 ℃回流提取6 h，冷卻，雙層紗布過濾，清洗3次濾渣并過濾，合并濾液。重復(fù)以上操作，多次提取，合并多次提取所得濾液，用布氏漏斗抽濾，得到的濾液為到手香稀溶液。于70 ℃溫度、-0.08 MPa壓力、60 r·min-1的條件下，對(duì)到手香稀溶液進(jìn)行減壓蒸餾濃縮[2]，得到到手香濃溶液。精密量取適量濃溶液，用蒸餾水稀釋后為到手香水提液，制成濃度為0.3、0.6、1.2 kg·L-1的高、中、低三個(gè)劑量溶液，供鎮(zhèn)咳祛痰實(shí)驗(yàn)用。

2.2 到手香水提液鎮(zhèn)咳作用試驗(yàn)(對(duì)氨水引起小鼠咳嗽的影響)設(shè)計(jì)[3-6]

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用改進(jìn)的引咳實(shí)驗(yàn)裝置，在恒壓條件(壓力為101 kPa)下對(duì)小鼠進(jìn)行氨引咳。因?yàn)樾∈笮詣e變化會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中的梯度，因此本實(shí)驗(yàn)采用雄性動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 動(dòng)物分組 選擇健康，體質(zhì)量在18.0～22.0 g的NIH小鼠共75只，并按照體質(zhì)量進(jìn)行排序分層，再采用層內(nèi)單純隨機(jī)法分成5組，每組15只小鼠。設(shè)為：陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽性對(duì)照組(美沙芬溶液，給藥劑量為0.03 g·kg-1)、到手香水提液高、中、低三個(gè)劑量組。并根據(jù)初試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果按倍量法設(shè)定給藥劑量為24、12、6 g·kg-1。

2.2.3 試驗(yàn)方法 小鼠灌胃給藥(0.4 mL/20 g)1 h后，將小鼠放入密閉玻璃缸中，依據(jù)序貫法原則按預(yù)定的時(shí)間噴入濃氨水氣霧，噴霧結(jié)束后立即取出小鼠，觀察1 min內(nèi)是否有咳嗽反應(yīng)。咳嗽判斷方法:若1 min內(nèi)出現(xiàn)3次及以上典型咳嗽動(dòng)作(腹肌收縮或縮胸，同時(shí)張大嘴，有時(shí)可有咳聲)者，算作“有咳嗽”。否則算作“無咳嗽”。以停止接觸氨水刺激之后1 min內(nèi)咳嗽次數(shù)不小于3次判為陽性，若個(gè)別動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)死亡或休克亦判為咳嗽陽性。其首次咳嗽時(shí)間以及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)同時(shí)作為科學(xué)數(shù)據(jù)作其它處理。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 用序貫法(上下法)求出引起半數(shù)小鼠咳嗽的噴霧時(shí)間(EDT50)。計(jì)算R值，若R值大于130%，即表明藥物具有止咳作用。若R值大于150%，即表明藥物有顯著的止咳作用。計(jì)算公式：EDT50=log-1c/n[式中n為動(dòng)物數(shù)，c為rx值的總和，r為每劑量組的動(dòng)物數(shù)，x為劑量(即噴霧時(shí)間)的對(duì)數(shù)]。R=給藥組的EDT50/對(duì)照組的EDT50×100%。

2.3 到手香水提液祛痰作用試驗(yàn)(對(duì)小鼠氣管酚紅排泄量的影響)設(shè)計(jì)[4-7]

2.3.1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取一定量的酚紅，用5%碳酸氫鈉溶解，配成每1 mL含12.5 ng的溶液，然后順次進(jìn)行倍比稀釋成每毫升含酚紅6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7、0.048 8 ng的溶液，用分光光度計(jì)于546 nm波長測(cè)定其光密度(OD值)，計(jì)算回歸方程：酚紅含量=OD值×7.626 6-0.055 4，r=0.995 6，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 試驗(yàn)方法 取健康NIH小鼠50只，按照體質(zhì)量進(jìn)行排序，采用隨機(jī)區(qū)組分組法分成5組，每組10只小鼠，設(shè)為：陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽性對(duì)照組(0.01 kg·L-1痰咳凈溶液，給藥劑量為0.2 g·kg-1)、到手香水提液高、中、低劑量組，根據(jù)初試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果按倍量法設(shè)定給藥劑量為24、12、6 g·kg-1。小鼠禁食不禁水12 h后，灌胃0.4 mL/20 g，30 min后經(jīng)腹腔注射5%酚紅生理鹽水溶液0.2 mL/20 g，30 min后采用斷頸椎法處死小鼠，剪下小鼠氣管，放入預(yù)先盛有1.5 mL的5% NaHCO3溶液試管中，超聲5 min，促使氣管段中的酚紅釋放出來。將各試管中溶液于分光光度計(jì)546 nm處測(cè)OD值。將各試管含氣管段放置過夜，24 h后重測(cè)OD值。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)酚紅含量和動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)算出校正酚紅含量，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算公式：校正酚紅含量= 酚紅含量(ng)/小鼠體質(zhì)量(kg)；化痰率(%)= 給藥組校正酚紅含量/空白對(duì)照組校正酚紅含量×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)指標(biāo)中的酚紅含量等為計(jì)量資料，比較采用單因素方差分析+兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)。化痰率等為計(jì)數(shù)資料，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 到手香水提液鎮(zhèn)咳作用試驗(yàn)(對(duì)氨水引起小鼠咳嗽的影響) 本實(shí)驗(yàn)中陽性對(duì)照藥物美沙芬的鎮(zhèn)咳效果R=133.63%，即鎮(zhèn)咳效果為有效，說明本實(shí)驗(yàn)條件結(jié)果可靠。樣品組的R>130%，說明到手香水提液對(duì)氨水誘導(dǎo)的小鼠咳嗽有明顯的鎮(zhèn)咳作用，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 到手香水提液對(duì)小鼠鎮(zhèn)咳藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“—”表示此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

表2 到手香水提液對(duì)小鼠祛痰藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05。

3.2 到手香水提液祛痰試驗(yàn)(對(duì)小鼠氣管酚紅排泄量的影響) 本實(shí)驗(yàn)中陽性對(duì)照藥物痰咳凈的祛痰率為291.30%，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明本實(shí)驗(yàn)條件結(jié)果可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，到手香水提液使小鼠氣管酚紅排泄量增加，有明顯的祛痰作用,具體數(shù)據(jù)見表2。

4 討論

氨水具有強(qiáng)烈的刺激性嗅味，用空壓機(jī)將濃氨水通過霧化器霧化噴入動(dòng)物容器內(nèi)，小鼠吸入后，刺激呼吸道感受器，即可引發(fā)反射性咳嗽。凡能抑制咳嗽中樞或降低呼吸道感受器敏感性的藥物均有鎮(zhèn)咳作用[8]，即能抑制氨水引起的咳嗽。本實(shí)驗(yàn)中到手香水提液高中低劑量組均具有明顯的鎮(zhèn)咳作用，而到手香水提液鎮(zhèn)咳藥理作用機(jī)制是屬于中樞性還是屬于外周性，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。動(dòng)物呼吸道分泌量增多，有利于附著呼吸道黏膜的濃痰變稀，從氣管壁脫落，起到祛痰作用。小鼠腹腔注射酚紅生理鹽水后，酚紅會(huì)隨呼吸道分泌液排出，酚紅排泌量的多少可以反映出呼吸道分泌液的量。本實(shí)驗(yàn)中到手香水提液能增加小鼠氣管酚紅排泌量，有利于附著氣管黏膜的濃痰變稀，從氣管壁脫落，起到祛痰作用。到手香水提液含有蛋白質(zhì)、氨基酸、皂苷、鞣質(zhì)、糖及其苷類、酚類和有機(jī)酸等化學(xué)成分[9]；其中鎮(zhèn)咳祛痰作用的有效成分及其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和探討。因?yàn)橛行┧幱弥参锞哂墟?zhèn)咳祛痰作用，同時(shí)也具有平喘作用，筆者曾進(jìn)行豚鼠離體氣管平滑肌收縮的影響實(shí)驗(yàn)、2%乙酰膽堿和0.1%組織胺混合液噴霧致喘豚鼠的影響實(shí)驗(yàn)[10]，對(duì)到手香水提液平喘作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示到手香水提液對(duì)噴霧致喘豚鼠的引喘潛伏期、對(duì)豚鼠離體氣管平滑肌收縮均沒有顯著抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中到手香水提液有明顯鎮(zhèn)咳祛痰作用，為進(jìn)一步藥效學(xué)研究及合理開發(fā)利用到手香提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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