韋婕,陳建,胡冰,季楚舒

(安徽省立醫(yī)院腫瘤科,安徽 合肥 230001)

惡性腹水為晚期惡性腫瘤的常見并發(fā)癥。引發(fā)惡性腹水的原發(fā)病以卵巢癌最常見，其他可見于胃腸道腫瘤、胰腺癌、子宮癌。大部分患者中位生存期為數(shù)周至數(shù)月。眾所周知，新生血管的生成及血管通透性的增加與惡性腹水的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，因此抗血管靶向治療應(yīng)運而生。重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)具有多靶點抗血管生成作用?，F(xiàn)有的基礎(chǔ)研究及臨床研究均顯示恩度在惡性腹水治療中具有較好的療效及安全性[1-4]。但目前恩度給藥劑量、頻率以及給藥方式的標(biāo)準(zhǔn)不一，為臨床參考帶來了一定的困難。本研究從劑量標(biāo)準(zhǔn)出發(fā)，通過不同劑量恩度給藥，比較各組間腹水療效的差異，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 ICR小鼠160只購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量16～18 g，雄性，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，動物資格許可證號：SCXK(京)2012-0001。小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞(EAC細(xì)胞)由勇山生物科技公司培育。重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)由先聲藥物有限公司提供(批號201603013)，用生理鹽水配置成所需劑量，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 建立小鼠腹水瘤模型 復(fù)蘇并擴(kuò)增EAC細(xì)胞，用不含血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升5×107個，取0.1 mL細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔內(nèi)傳代。待小鼠出現(xiàn)腹水后(接種第7～9天)斷頸處死小鼠，無菌條件下抽取腹水，放入離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入生理鹽水吹洗，再離心，共2次。再用生理鹽水稀釋腫瘤細(xì)胞懸液每毫升2.0×107個細(xì)胞。取該懸液每只0.1 mL(相當(dāng)于每只細(xì)胞數(shù)2.0×106個)接種于160只小鼠腹腔。

1.3 實驗分組與給藥 接種EAC細(xì)胞次日(第1天)將160只小鼠依體質(zhì)量隨機分成5組，每組32只，每組隨機解剖12只小鼠，用注射器采集腹水，6只檢測腹膜通透性，6只取腹膜組織備用。余小鼠按組依次腹腔給予相同體積的生理鹽水(Control組),12.5、25、50、100 mg·kg-1恩度，于第1、3、5天分別給藥1次。第7天每組隨機解剖13只小鼠，采集腹水，7只檢測腹膜通透性，6只取腹膜組織備用。每組剩余7只小鼠觀察生存期。

1.4 觀察指標(biāo)和檢測方法 (1)體質(zhì)量：從第1天起隔日測量每只小鼠的體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量變化曲線；(2) 腹圍：從第1天起隔日測量每只小鼠的腹圍，繪制腹圍變化曲線；(3)腹水性狀:第7天采集腹水，記錄各組腹水顏色；(4)腹膜通透性:從小鼠尾靜脈注射0.2 mL 5%伊文思藍(lán)(5%Evan藍(lán))，2 h后處死小鼠，收集腹水，將腹水離心5 min后取上清用酶標(biāo)儀檢測540 nm波長處Evan藍(lán)的吸光度(OD540)，間接反映Evan藍(lán)的濃度，從而分析腹膜通透性;(5)生存期:記錄各組剩余7只小鼠的存活時間，繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 對體質(zhì)量變化的影響 各組小鼠體質(zhì)量測量結(jié)果及變化曲線分別見表1和圖1。第1天給藥前各組小鼠體質(zhì)量差異不明顯。第9天各組小鼠的體質(zhì)量均較第1天增加，各恩度治療組體質(zhì)量均輕于Control組，劑量分組對體質(zhì)量影響明顯(F=3.220，P=0.027)，其中僅100 mg·kg-1恩度組與Control組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量

注：與Control組比較，aP<0.05。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化曲線

2.2 對腹圍變化的影響 各組小鼠腹圍測量結(jié)果及變化曲線分別見表2和圖2。第1天給藥前各組小鼠腹圍差異不明顯。第9天各組小鼠的腹圍均較第1天增加，恩度劑量分組對腹圍影響明顯(F=6.791，P=0.001)，其中50、100 mg·kg-1組腹圍均小于Control組，50 mg·kg-1恩度組與Control組的差異(P=0.011)、100 mg·kg-1恩度組與Control組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010)，但50 mg·kg-1與100 mg·kg-1組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 采集腹水情況 第7天處死小鼠，無菌注射器采集腹水。經(jīng)5%Evan藍(lán)處理后的腹水外觀均呈藍(lán)色。排除個體差異情況下，整體觀察，與Control組相比，隨著恩度劑量增加，腹水血性成分整體呈減少趨勢。且100 mg·kg-1恩度組的腹水量整體較少，部分小鼠未采集到明顯腹水。

圖2 各組小鼠腹圍變化曲線

2.4 對腹膜通透性的影響 第1、7天各組腹水OD540值見表3和圖3。第1天由于小鼠腹水尚未生長，故予腹腔注射4 mL無菌生理鹽水后行5%Evan藍(lán)檢測吸光度，各組OD540均為0.4左右，各組之間差異不明顯。第7天各組OD540均較第1天增大，且各恩度組OD540均小于Control組，但恩度劑量分組對OD540影響不明顯(F=0.773，P>0.05)，各組間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 對生存情況的影響 各組小鼠生存情況及生存曲線分別見表4和圖4。中位生存時間最長的為50 mg·kg-1劑量組，且該組的生存曲線較其他組下降相對平緩。至第22天其余組小鼠均死亡，50 mg·kg-1組仍有2只小鼠生活狀態(tài)良好，實施安樂死，解剖腹腔未見明顯腹水。但與Control組相比，各恩度劑量組小鼠生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠腹水OD540值比較

圖3 各組小鼠第1天和第7天腹水OD540值

表2 各組小鼠腹圍變化的比較

注：與Control組比較，aP<0.05。

表4 各組小鼠生存情況

注：a:于第22天將2只尚存活的小鼠用CO2人為安樂死，第22天為刪失數(shù)據(jù)。

圖4 各組小鼠生存曲線

3 討論

惡性腹水往往預(yù)示著癌癥晚期，大量腹水可導(dǎo)致患者腹式呼吸受限、食欲減少，睡眠質(zhì)量下降，腸梗阻發(fā)生率升高，低蛋白血癥及繼發(fā)性貧血，加重或誘發(fā)惡液質(zhì)的發(fā)生，患者往往一般狀況差，預(yù)后不佳，中位生存期短，因此惡性腹水的治療在提高晚期癌癥患者的生活質(zhì)量，延長其生存期具有重要意義[5]。目前臨床常用的處理方式主要有限制液體入量，改善低蛋白血癥，常規(guī)應(yīng)用利尿劑，腹腔置管引流，腹腔熱灌注化療，免疫治療及腹腔靜脈分流術(shù)等[6-7]，但療效均不理想，且反復(fù)抽液、腹腔化療易刺激腹膜、加重蛋白丟失、誘發(fā)腸粘連、腸梗阻等。

隨著對腹水形成機制的探究，Tamsma等[8]提出腹水的產(chǎn)生主要與兩條途徑相關(guān)，淋巴吸收的減少以及腹膜腔內(nèi)液體產(chǎn)生的增多。當(dāng)腫瘤細(xì)胞侵犯或轉(zhuǎn)移至腹膜時，腫瘤細(xì)胞會分泌多種生物活性肽，后者可促進(jìn)新生血管的生成，致毛細(xì)血管內(nèi)膜的總面積增加及血管通透性的升高，蛋白質(zhì)滲出致腹腔內(nèi)膠體滲透壓升高，最終導(dǎo)致了腹腔內(nèi)大量液體的產(chǎn)生。這些生物活性肽主要是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子[9]。目前已有多項研究顯示了VEGF在血管通透性、血管生成方面的重要作用[10]。O′Reilly等[11]發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮抑素可通過與血管內(nèi)皮的VEGF受體特異性結(jié)合阻礙血管內(nèi)皮增生。恩度是我國研發(fā)的新型重組人血管內(nèi)皮抑素，可直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及分化，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，多靶點抗腫瘤血管的生成[12]。目前已有多項臨床研究表明，恩度聯(lián)合化療腹腔給藥具有較好的近期療效，可改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量，不增加化療的毒性反應(yīng)，為惡性腹水的治療提供了新途徑[13-15]。

我們在臨床工作中發(fā)現(xiàn)一定范圍下增加恩度給藥劑量，患者腹脹癥狀及腹水消退的效果越來越明顯，同時部分患者出現(xiàn)了胸悶、心慌等不適。藥物劑量是影響療效的一項關(guān)鍵因素，劑量過低可能無明顯療效，過高易加重藥物的毒副反應(yīng)。因此，我們設(shè)想恩度腹腔給藥是否存在最佳劑量。但目前的報道尚無明確標(biāo)準(zhǔn)，已有文獻(xiàn)中多為小樣本的臨床觀察，聯(lián)合化療恩度劑量每次15～60 mg不等，動物實驗劑量大多為8 mg·kg-1，缺乏高級別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。本實驗將恩度稀釋為4個劑量組(12.5、25、50、100 mg·kg-1)，以生理鹽水為對照實驗，多方面對比療效。

實驗結(jié)果顯示，高劑量組50、100 mg·kg-1在體質(zhì)量、腹圍指標(biāo)上呈現(xiàn)陽性結(jié)果。臨床上腹水明顯時，最簡單、直觀的表現(xiàn)就是體質(zhì)量增加、腹圍增大，而腹圍大小與腹水量息息相關(guān)，故該指標(biāo)可間接反映藥物抑制腹水生成的療效。與Control組相比，100 mg·kg-1劑量組可明顯降低小鼠體質(zhì)量和腹圍(P<0.05)，顯示出該劑量對腹水的抑制作用。而50 mg·kg-1劑量組相對Control組小鼠腹圍明顯減小(P<0.05)，但體質(zhì)量下降不明顯，我們考慮可能與小鼠靈活好動，稱重時并非完全靜態(tài)，存在稱重誤差相關(guān)。

采集腹水時我們觀察到在排除個體差異情況下，隨著恩度的劑量加大，腹水血性成分減少，提示恩度對血性積液的產(chǎn)生具有很好的抑制作用，且同劑量相關(guān)。當(dāng)腫瘤侵犯腹膜血管，腹膜通透性增高致大量紅細(xì)胞滲出，即引起血性腹水。本實驗結(jié)果與文獻(xiàn)[16-17]研究驗證的恩度對血性積液的療效相符。對于100 mg·kg-1組個別小鼠未采集到腹水，以及生存期最長的50 mg·kg-1組中2只小鼠安樂死后解剖腹腔未見腹水生成的情況，我們認(rèn)為除了模型接種失敗的原因外還可能是該劑量下藥物作用的結(jié)果，同時生存曲線中也顯示出50 mg·kg-1劑量組的優(yōu)勢。

此外，我們發(fā)現(xiàn)在相同的實驗背景下，文獻(xiàn)[19-20]的實驗中以恩度8 mg·kg-1給藥即呈現(xiàn)出理想的陽性結(jié)果，反觀本實驗中相對高劑量給藥體系仍出現(xiàn)的陰性結(jié)果，可能的解釋有：(1)兩位學(xué)者采用連續(xù)給藥，療程至少1周，而本課題隔天給藥，療程也相對較短；(2)文獻(xiàn)[17]選用的是H22腹水瘤細(xì)胞，而本課題以艾氏腹水瘤細(xì)胞構(gòu)建腹水模型，可能是不同的腹水瘤細(xì)胞對恩度療效的反應(yīng)不盡相同，值得深思的是提示臨床中不同瘤種來源的腹水對血管內(nèi)皮抑素的效果是否也存在差異，有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本實驗設(shè)計體系下，恩度50 mg·kg-1劑量和100 mg·kg-1劑量相對其他劑量組對腹水抑制作用明顯，可認(rèn)定為內(nèi)皮抑素腔內(nèi)給藥的有效劑量。前期動物實驗顯示恩度對腹水的抑制可能與降低腹水、腹膜組織中的血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的表達(dá)相關(guān)[18-19]。后續(xù)我們將對實驗采集的腹水及腹膜組織進(jìn)行VEGFR-2的檢測，從分子水平了解差異。同時鑒于實驗中各劑量組梯度較大，下一步可以圍繞著50～100 mg·kg-1進(jìn)一步細(xì)化劑量梯度，尋找給藥劑量與腹水量、VEGFR-2表達(dá)水平的關(guān)系，試圖了解腔內(nèi)給藥的最佳劑量。

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