耿曉玲

(江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)紡織工程系， 江蘇 江陰 214433)

小球藻為綠藻門小球藻屬單細(xì)胞綠藻,含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂類、微量元素和一些生物活性代謝產(chǎn)物[1-3],不僅廣泛應(yīng)用于保健食品、飼料、食品添加劑、精細(xì)化工品和醫(yī)藥制劑原料，在污水處理,水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料以及畜牧飼料添加劑的生產(chǎn)等方面也被廣泛應(yīng)用[4-5]。小球藻的培養(yǎng)方式主要有開放式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)。開放式培養(yǎng)由于受到自然條件如陽光、溫度等的影響和限制, 產(chǎn)量不穩(wěn)定，易受到他種生物的污染甚至取食,引起培養(yǎng)藻液的退化。封閉式培養(yǎng)相對而言便于控制、能抗污染、可提高產(chǎn)率，整個系統(tǒng)穩(wěn)定性好[6]。本文研究了封閉式培養(yǎng)條件下小球藻的生長，探討光照方式、光強以及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素對小球藻生長的影響，為提高小球藻的產(chǎn)量，增加藻粉的收率提供依據(jù)。

1 實驗儀器及試劑

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種:小球藻Chlorella zofingensis屬于綠藻門，直徑3～10微米，由中國科學(xué)院提供。培養(yǎng)基:BG-11。培養(yǎng)基BG-11主要成分見表1。

表1 培養(yǎng)基BG-11主要成分一覽表

A5按以下物質(zhì)稱量并定容至1000mL。A5成分見表2。

表2 A5成分明細(xì)表

1.2 主要儀器

主要儀器見表3。

表3 主要儀器一覽表

2 菌種的培養(yǎng)方法

2.1 菌種的分離純化

將BG-11瓊脂培養(yǎng)基放入水浴中加熱至融化，倒平板制得平板，將整個培養(yǎng)皿皿底劃分為1，2，3，4四個面積不等的部分，待用。挑取菌種，按照無菌操作流程進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

2.2 小球藻生長的通氣培養(yǎng)裝置

通氣培養(yǎng)裝置主要由長方體水槽，光源系統(tǒng)，控溫系統(tǒng)，水循環(huán)系統(tǒng)，空氣供給系統(tǒng)和CO2供給系統(tǒng)組成。容器為平板玻璃制成的長方體水槽，水槽底部設(shè)有有機玻璃支架；光源系統(tǒng)為4根日光燈直射；控溫系統(tǒng)由恒溫水浴、輸水管和熱交換器組成，控溫范圍0～50℃，控溫精度0.1℃；水槽內(nèi)水循環(huán)系統(tǒng)是由通氣沙頭組成，保持各部分水溫一致?？諝夤┙o系統(tǒng)由小型空氣泵、輸氣管、流量調(diào)節(jié)閥門和沙頭組成，供氣壓強0.04MPa，每個培養(yǎng)管的氣流大小都可單獨調(diào)節(jié)，獲得所需的氣流。pH值控制8～9的范圍內(nèi)。

2.3 菌種的擴大培養(yǎng)

將平板上的菌種接到2L錐形瓶中，使用無菌培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在室溫24°C的環(huán)境中進(jìn)行培育，培養(yǎng)至對數(shù)周期,接種至10L培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)周期。取藻液，4000r /min 離心8min，收集藻細(xì)胞，無菌水清洗兩次，再將離心收集的藻種分別接種于培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始OD550為0.5± 0.005，經(jīng)處理的藻液分裝入玻璃容器中，每個玻璃缸為35L，置于通氣培養(yǎng)裝置中，進(jìn)行通氣培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞干重的測定

將0.45μm濾膜放入烘箱中于65℃烘至恒重，編號，稱重，每組做3個平行，取平均值。已烘干至恒重的濾膜放入針頭濾器中，精確吸取5ml藻液于注射器內(nèi)，并注入到針頭過濾器中過濾，用蒸餾水沖洗2～3次，藻體連同濾膜放入65℃烘箱中烘至恒重，再稱重。

2.5 生長速率測定

采用BG-11 培養(yǎng)基，在200μmol m-2s-1，( 30 ± 1) ℃條件下通氣培養(yǎng)小球藻，接種后1～3d，藻液OD 值快速增長，第4天，增長速率明顯減緩，4d 以后，OD 值變化不明顯。所以，用培養(yǎng)前4d 的平均生長速率表示各種培養(yǎng)條件下小球藻的比生長速率μ(d-1)。

式中，OD1和OD2分別是剛接種和培養(yǎng)4d 的藻液OD 值，t1和t2是對應(yīng)的培養(yǎng)時間( d) ，t2-t1= 4(d)。

2.2.6 氮濃度對小球藻生長的影響

以硝酸鈉調(diào)節(jié)氮濃度，加入硝酸鈉的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L,其他各組分保持一致，實驗中的光源為日光燈照射，溫度控制在24℃左右,其他培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.7 Fe3+濃度對小球藻生長的影響

分別向5組玻璃缸( 每組3個平行樣) 補加FeCl3·6H2O 與EDTA-2Na 等物質(zhì)的量混合液，補加的Fe3+的濃度依次為0，0.1，0.3，0.5，0.7mol /L，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.8 不同磷濃度對小球藻生長的影響

分別向5組玻璃缸補加K2HPO4溶液，濃度依次為10，20，30，40，50mg /L，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.9 不同鹽度培養(yǎng)條件下小球藻的生長速率

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基NaCl濃度依次為0，0.1，0.3，0.5，0.7mol /L，培養(yǎng)4d后，測定生長速率。

2.2.10 光照對小球藻生長的影響

采用不同的光照方式，小球藻分3批進(jìn)行培養(yǎng)，分別為全光照，間隔光照，黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)11天，11天后對3批小球藻進(jìn)行干重測定，期間3批小球藻的培養(yǎng)基，pH值，溫度相同。將室內(nèi)培養(yǎng)的10L 瓶中的小球藻轉(zhuǎn)到室外，在全光照條件下調(diào)節(jié)光照強度，分別為1000，3000，5000，7000lux,培養(yǎng)11天，接種時密度控制在OD550為0.5± 0.005，培養(yǎng)方式為人工通氣。反應(yīng)器：“S”型反應(yīng)器，容量3500L。環(huán)境因素的測量方式為連續(xù)測量11天的光強，如遇到陰天，雨天正常進(jìn)行測量。生長數(shù)據(jù)的測量為每天下午2點進(jìn)行補水，2∶30進(jìn)行取樣測干重。

3.1 結(jié)果分析

3.1.1 不同氮濃度培養(yǎng)條件下的小球藻的生長速率

小球藻生長速率隨著培養(yǎng)基氮源濃度加大而提高，5組不同氮源濃度培養(yǎng)條件下，氮源濃度為0.1g/L時，其生長速率與其他4組差異極顯著，當(dāng)?shù)礉舛葹?.2g /L 時，生長速率與其他4組差異極顯著，氮源濃度為0.3g /L與0.4g /L 兩組間生長速率沒有顯著差異,0.4g/L小球藻的生長速率開始下降。不同氮濃度對生長速率的影響見圖1。

圖1 不同氮濃度對生長速率的影響

氮是微藻生長必需的大量元素之一，對于藻類的生長、繁殖等生理活動有著重要的作用，不同的藻種對氮源的要求有差異，氮源的種類、濃度發(fā)生變化，會影響微藻的生理生化特性，如微藻的生長狀況，類胡蘿卜素的積累，胞外多糖的產(chǎn)生，脂肪酸含量以及酶活性等。實驗表明氮濃度對小球藻的生長速率有著顯著的影響，隨著氮濃度的增加，生長速率提高了,0.4g/L小球藻的生長速率開始下降。

3.1.2 不同鐵濃度培養(yǎng)條件下小球藻的生長速率

鐵濃度的變化沒有對小球藻的生長產(chǎn)生明顯的影響。統(tǒng)計分析表明，不同濃度Fe3+( 10～160mg /L) 培養(yǎng)小球藻，生長速率沒有顯著差異。不同鐵濃度對小球藻生長速率的影響見圖2。

圖2 不同鐵濃度對小球藻生長速率的影響

鐵元素是植物生長所必需的微量元素，但在實驗中表明Fe3+對生長速率的影響不大。

3.1.3 不同磷濃度培養(yǎng)條件下小球藻生長速率

磷濃度的變化沒有對小球藻的生長產(chǎn)生明顯的影響。統(tǒng)計分析表明，不同濃度K2HPO4( 10～50mg /L) 培養(yǎng)小球藻，生長速率沒有顯著差異。不同磷濃度對小球藻生長速率的影響見圖3。

圖3 不同磷濃度對小球藻生長速率的影響

磷濃度增加至30～40mg/L 時小球藻的生長速度最快但不明顯表明。說明小球藻對磷濃度變化的適應(yīng)能力很強，磷濃度的變化不會影響其生長。

3.1.4 不同鹽度培養(yǎng)條件下小球藻的生長速率

NaCl 濃度不高于0.4mol /L 時，小球藻生長速率隨鹽濃度的增加而增加，NaCl 濃度0.4mol /L 之后生長速率開始下降。不同鹽度對小球藻生長速率的影響見圖4。

有關(guān)鹽度對小球藻生長、光合速率、葉綠素含量的研究已有一些報道，一般來講小球藻對鹽度有較強的適應(yīng)性，但鹽度過高時藻體開始出現(xiàn)發(fā)白、沉底現(xiàn)象，以后藻體陸續(xù)死亡。

本研究中，在鹽度不高于0.4mol /L 的范圍內(nèi)，鹽度增高對小球藻生長影響不顯著，當(dāng)鹽度達(dá)到0.5mol時，生長速率開始降低，鹽度為0. 4mol /L 時，小球藻的生長速率達(dá)到最高。

3.1.5 光照對小球藻生長的影響

光照方式對小球藻生長的影響見表4，表5光照強度對小球藻生長的影響。

表4 光照方式對小球藻生長的影響

表5 光照強度對小球藻生長的影響

最后獲得小球藻干重分別為0.985g，0.761g，0.243g。由此可見，小球藻在全光照條件下能夠正常的生長，間隔光照條件下小球藻的生長受到了一定的影響，在黑暗條件下小球藻生長的極其緩慢。在全光照條件下，光照強度也影響著小球藻的生長，在3000～5000lux之間，小球藻的生長情況良好，光照強度過低或過高不利于小球藻的生長。

隨著小球藻應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，其發(fā)展前景將更加廣闊。而小球藻的大量生產(chǎn)影響著小球藻的研究與發(fā)展。本文從培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分分,光強別加以討論分析，得出以下結(jié)論：在小球藻的培養(yǎng)過程中，氮濃度對小球藻的生長速率有著顯著的影響，隨著氮濃度的增加，生長速率提高到0.4g/L時，小球藻的生長速率達(dá)到最佳。Fe3+對小球藻的影響不大。小球藻對磷濃度變化的適應(yīng)能力很強，30～40mg/L 時小球藻的生長速度最快，但不明顯?？傮w來說鐵元素與磷元素在此實驗中對小球藻的生長速率沒有顯著的影響。在鹽度不高于0.4mol /L 的范圍內(nèi)，鹽度增高對小球藻生長影響不顯著，當(dāng)鹽度達(dá)到0.5mol時，生長速率開始低，鹽度為0.4mol /L 時，小球藻的生長速率達(dá)到最高。

在光照對比實驗中發(fā)現(xiàn)全光照有利于小球藻的生長，而在黑暗條件中小球藻生長緩慢。在全光照條件下,小球藻在3000～5000lux之間生長情況良好，光照強度過低或更高不利于小球藻的生長。

[1] 李師翁,李虎乾.小球藻干粉的營養(yǎng)學(xué)與毒理學(xué)研究[J].食品科學(xué),1997,18(7):48- 51.

[2] 黃冠華,陳 峰,任慶功.應(yīng)用小球藻制備生物柴油[J].太陽能學(xué)報,2010，31(9):1085-1091.

[3] 胡月薇,邱承光.小球藻處理廢水研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2003,26(4):48-49.

[4] Chen Ying, Wang Yiqin,Sun Yongru,et al.Highly efficient expression of rabbit neutrophil peptide-1 gene in chlorella ellip so idea cells[J].Curr Genet,2001,39:365-370.

[5] 王業(yè)勤,李勤生.小球藻應(yīng)用研究動態(tài)[J].微生物學(xué)通報,1985,12(6):275-277.

[6] 李師翁,李虎乾,張建軍.小球藻大規(guī)模培養(yǎng)研究的進(jìn)展[J].植物學(xué)報,1998,15(4):14-18.

(本文文獻(xiàn)格式：耿曉玲.小球藻培養(yǎng)的初步研究[J].山東化工，2018，47(02)：35-37,39.)