彭禮繁，張小建，廖梅旭，李曉潔，余 鯤

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院輔助生殖醫(yī)學(xué)中心，四川 成都 610072)

卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是無精子癥患者獲得自己遺傳學(xué)后代的重要輔助手段。在無精子患者中，男方的精子質(zhì)量與臨床妊娠結(jié)局是密切相關(guān)的。無精子癥患者通過手術(shù)獲得的精子數(shù)量非常稀少，行ICSI很難找到活動的精子，這對后期的胚胎發(fā)育和臨床妊娠結(jié)局會造成不利影響。精子激動劑SperMagic是一種有效提高精子活力的激動劑，有報道發(fā)現(xiàn)它可以促進精子的能量激發(fā)，增強精子活力，縮短ICSI操作時間和改善ICSI妊娠結(jié)局[1～3]。本研究通過比較無精癥患者應(yīng)用精子激動劑SperMagic前后精子活力的改變，以及對受精率、雙原核(2PN)率、卵裂率、可利用胚胎率、D3優(yōu)胚率、臨床妊娠率和著床率等胚胎發(fā)育參數(shù)的影響，探討精子激動劑SperMagic在無精子癥患者中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料2015年1月至2016年12月就診于我中心行胞漿內(nèi)單精子顯微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的不孕周期患者95例，均獲得患者的知情同意。男方排除重大疾病和遺傳性疾病，根據(jù)第五版WHO標準診斷為非梗阻性無精子癥，對其采用經(jīng)皮睪丸穿刺精子抽吸術(shù)(Testicular sperm aspiration，TESA)獲得精子。將行TESA-ICSI的患者依據(jù)是否添加精子激動劑SperMagic分為：使用精子激動劑SperMagic的新鮮精子組(A組)20例，使用精子激動劑SperMagic的解凍精子組(B組)54例和正常TESA精子組(C組)21例，其它行ICSI的嚴重少弱精子癥患者為對照組(D組)647例。

1.2方法

1.2.1促排卵方案 采用常規(guī)長方案超促排卵，前一月經(jīng)周期的第19～21日用曲普瑞林(達菲林，法國益普生公司)1.3～1.8 mg降調(diào)節(jié)，月經(jīng)第2～3日查血黃體生成素(luteinizing hormone releasing hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)值，達充分降調(diào)節(jié)標準后用果納芬(Gonal-F，瑞士Serono)或麗申寶(中國麗珠公司)促排卵，當超聲檢查顯示至少3個直徑≥17 mm的卵泡時，當日患者接受5 000～10 000 U的HCG(中國麗珠制藥)以誘發(fā)卵泡成熟，32～36 h后，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下采卵。

1.2.2精子獲得及處理 由男科醫(yī)生對患者直接采用TESA取精。如為取卵當日，采用1 ml注射器針頭對睪丸組織充分撕碎后，行單層密度梯度離心法洗滌，置于室溫備用ICSI。如為診斷性穿刺，經(jīng)TESA獲得的睪丸組織充分撕碎后鏡下見到精子，立即行精子冷凍，保存精源。采用本實驗室自配的20%甘油的精子冷凍液，與精子混懸液 1：1比例充分混合后，置精子冷凍管中，在液氮氣相中懸吊暴露15 min后，投入液氮中冷凍保存。取卵日有成熟卵子即可解凍精子，方法是從液氮中取出冷凍管，迅速將其投入到38 ℃水浴5 min溶解后，用單層密度梯度離心法洗滌，置于室溫備用ICSI。

1.2.3精子激動劑SperMagic的使用 該產(chǎn)品是美國專利局的注冊產(chǎn)品，其主要成分為苯甲酸鈉咖啡因和肌苷。每瓶0.5 ml。在ICSI前，用巴氏吸管吸取SperMagic 3μL左右，加入ICSI皿的精子懸液中，37 ℃保存5 min后，在倒置顯微鏡下找到運動的精子，制動后行ICSI。

1.2.4受精和胚胎培養(yǎng) ICSI后18～19 h后觀察卵胞漿內(nèi)出現(xiàn)2PN為正常受精，其余為異常受精。受精卵在卵裂培養(yǎng)液(G-1)中繼續(xù)培養(yǎng)至72 h觀察發(fā)育情況，并進行胚胎分級。以胚胎細胞數(shù)≥6個，卵裂球大小較為均勻，碎片≤20%為可用胚胎。于取卵后72 h移植，移植胚胎數(shù)目1～2枚，胚胎移植后給予黃體酮支持黃體。移植后14 d左右測血hCG，移植29～31d行B超檢查，發(fā)現(xiàn)孕囊即為臨床妊娠。

1.3胚胎的評估標準按照本中心常規(guī)胚胎評分標準，48 h發(fā)育為4細胞，72 h細胞數(shù)為7～9細胞，碎片≤15%，大小稍有差異，即最大的卵裂球與最小卵裂球體積比<1.5，為第3天優(yōu)質(zhì)胚胎；72 h相比48 h有發(fā)育且細胞數(shù)4～12細胞、碎片程度≤ 30%，為可利用胚胎。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差或率(%)表示，組間兩兩比較采用t檢驗或卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P< 0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者基本情況比較A、B、C、D組患者的年齡、不孕年限、促性腺激素(Gonadotropin，Gn)用量、Gn使用天數(shù)及獲卵數(shù)等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。C組患者的精子活力(0.9%)顯著低于A、B、D組患者的精子活力(11.8%、10.1%、14%)(P< 0.01)。見表1。

2.2患者的胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較從精子活力、受精率、2PN率、卵裂率、D3優(yōu)胚率、可利用胚胎率、臨床妊娠率和著床率來看，C組患者顯著低于其他三組(P< 0.01)。A、B、D組患者在受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、臨床妊娠率和著床率等胚胎發(fā)育參數(shù)上組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。D組在D3優(yōu)胚率也明顯高于A組和B組(P< 0.01)。四組在多PN率上組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

表1 四組患者的胚胎發(fā)育參數(shù)比較

＊與A，B，D組比較，P< 0.05

3 討論

精子的選擇對于ICSI臨床妊娠結(jié)局十分重要，ICSI操作可能將有遺傳基因缺陷的精子注射到卵子內(nèi)，影響其受精、后期胚胎發(fā)育乃至妊娠結(jié)局[4]。有研究通過分析數(shù)千例ICSI治療周期，發(fā)現(xiàn)精液中即使無活動精子，或無正常形態(tài)的精子，仍可能妊娠，關(guān)鍵在于是否找到一條活精子注射入卵子中[5]。有研究通過ICSI周期當中無精子癥患者的積累分析，發(fā)現(xiàn)活動精子多的組，就更容易挑選到正常形態(tài)的精子，其臨床妊娠率要明顯高于活動精子少的組[6]。

精子激動劑SperMagic是美國專利局的注冊產(chǎn)品，在短時間內(nèi)可以顯著提高精子的活力，并使其運動能力增強，應(yīng)用在ICSI中具有很好的效果。研究表明[7]，它具有明顯提高精子活力和運動能力的功能，尤其是對少弱精子、附睪和睪丸穿刺的精子有顯著的效果。它通過増進精子的活力，可以極大地縮短精子注射和卵子體外操作的時間，提高受精率和可利用胚胎數(shù)量，直接或者間接地提高臨床妊娠率。同時其對冷凍后因脂膜損傷和線粒體功能受損的精子(如捐精)具有顯著増強其功能的作用。此外，精子激動劑SperMagic對于少弱精子，尤其百萬條精子數(shù)目以下的患者，可免去ICSI，成功地嘗試人工授精，明顯地提高臨床妊娠率。其作用機理為：①通過作用于精子脂膜上的鈣離子通道，來增加鈣離子的內(nèi)流，激活鈣離子偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，來增加精子微管的動力學(xué)，進而增加精子尾部的運動能力，提高精子的活力。②通過結(jié)合精子脂膜上的受體，激活受體偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，以及鈣離子內(nèi)流機制，來促進精子的獲能和超激活運動。③通過促進精子尾部中段線粒體呼吸機制，來增加線粒體 ATP 的生成，進而為精子的運動提供能量。目前研究表明[8]：應(yīng)用精子激動劑SperMagic對臨床妊娠結(jié)局沒有造成影響，短期觀察沒有降低胚胎發(fā)育潛能。它能顯著性提高無精癥患者的精子活力，使經(jīng)解凍后無活力的TESA冷凍精子，轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動精子，極大地改善胚胎發(fā)育參數(shù)及臨床妊娠結(jié)局，同時還有效的降低了取卵周期取消率。

本研究使用的精子激動劑SperMagic通過Ca2+離子信號通路來激活精子活力，促使其尾部擺動，增強精子運動能力，使原來不動的活精子擺動起來。無精癥患者通過ICSI技術(shù)獲得臨床妊娠，精子的存活與否是非常重要的。通過TESA手術(shù)獲得的精子預(yù)先冷凍保存起來，可防止因取卵日精子獲取失敗導(dǎo)致助孕取消，還可以實現(xiàn)日后對于無精子癥患者的多次ICSI手術(shù)。本研究結(jié)果顯示：無精癥患者精液中添加精子激動劑SperMagic后，與未添加前相比，雖然其精子密度無改善，但是運動精子活力均得到顯著地提高(P< 0.01)。

目前，有關(guān)精子質(zhì)量與輔助生殖妊娠結(jié)局的研究逐漸被學(xué)者們引起重視。有報道發(fā)現(xiàn)在精液中應(yīng)用精子激動劑SperMagic以后，患者ICSI的受精率、優(yōu)胚率和臨床妊娠率均高于對照組(P> 0.05)[9～12]。本研究結(jié)果顯示，C組與A、B組相比較，在受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、臨床妊娠率和著床率等胚胎發(fā)育參數(shù)上均較低。A、B組在添加精子激動劑SperMagic后，各項指標均有較明顯的提高，與對照組有相近的妊娠結(jié)局。原因是在新鮮精子或解凍精子加入精子激動劑SperMagic后，通過精子脂膜上的Ca2+離子信號通路，促進鈣離子內(nèi)流并結(jié)合受體，使其獲能，增強了精子活力，縮短了精子注射和卵子體外操作的時間，提高受精率、2PN率、卵裂率和可利用胚胎率，從而間接地提高臨床妊娠率。本文分析原因是睪丸精子已完成減數(shù)分裂，在功能上具備卵子激活因子，可誘導(dǎo)內(nèi)源性鈣離子釋放激活卵子，可以完成卵裂和形成正常胚胎。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)了A、B組在D3優(yōu)胚率上明顯低于D組(P> 0.05)，究其原因無精子患者與對照組相比較，其精子的獲得均通過TESA手術(shù)來完成，精子均來源于睪丸組織，精子成熟度和精子獲能性均低于對照組。雖然從外觀上來看，其活力與對照組沒有明顯的差異，其精子DNA碎片等參數(shù)可能遠低于對照組，進而造成D3優(yōu)胚率明顯低于D組。

有研究發(fā)現(xiàn)等通過手術(shù)獲取的睪丸精液中隨機分組添加精子激動劑SperMagic，發(fā)現(xiàn)研究組的活動精子數(shù)量顯著增多，試驗組的睪丸精子每視野為0～1條活動精子，ICSI在體外操作時間明顯降低，這與我們的研究發(fā)現(xiàn)是一致的[13]。他們的試驗發(fā)現(xiàn)通過添加精子激動劑SperMagic，其受精率和著床率均有顯著提高，這與我們研究也是一致的[14，15]。我們還發(fā)現(xiàn)試驗組在受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、臨床妊娠率和著床率均顯著高于對照組，可見精子激動劑SperMagic可以顯著改善妊娠結(jié)局。

綜上所述，精子激動劑SperMagic是一種很好的精子能量促進劑，能增強精子的尾部動力和提高精子的活力，通過對精子膜完整性的保護，減少氧自由基對精子內(nèi)部的物理性損傷，對于精子超顯微結(jié)構(gòu)的異常也可以起到保護作用，在ICSI當中的應(yīng)用具有很好的效果。精子激動劑SperMagic能夠提高無精癥患者睪丸精子的受精能力和后期胚胎發(fā)育參數(shù)，縮短ICSI對卵子的體外操作時間，有效地提高臨床妊娠率及著床率，短期觀察其對胚胎沒有造成損傷。但是，國內(nèi)目前對于精子激動劑SperMagic在臨床上的應(yīng)用報道還比較少，本研究的樣本數(shù)量還遠遠不夠，它在大樣本中對于受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、臨床妊娠率和著床率等胚胎發(fā)育參數(shù)的影響，及其對子代遠期影響還不是很清楚，需要今后進一步的大樣本統(tǒng)計分析。

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