李敬東，韓效林，楊 翠，孫 玲

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南 新鄉(xiāng) 453100；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450052)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是指骨髓未能生產(chǎn)足夠或新的細(xì)胞來補充血液細(xì)胞的情況[1]。AA患者三種血液細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板)均出現(xiàn)降低情況[2，3]。有研究表明，AA的發(fā)生及發(fā)展與骨髓中造血干細(xì)胞的免疫性損傷有緊密關(guān)系，其自身免疫反應(yīng)會被不同的刺激物激活，從而釋放出如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等造血負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子[4]，造成造血干細(xì)胞分裂受阻而凋亡，臨床上有關(guān)淋巴細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)甚少[5，6]，為此本研究運用流式細(xì)胞術(shù)檢查接受免疫抑制治療前后的AA患者，進(jìn)行外周血VEGF、TNF-α和IFN-γ表達(dá)變化及臨床意義分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料兩院2012年1月至2014年4月收治的30例AA初發(fā)患者設(shè)為對照組，2014年5月至2016年4月收治的30例經(jīng)免疫抑制治療后的AA患者設(shè)為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)臨床癥狀及外周血象、骨髓涂片及活檢確診；②均符合AA診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)；③年齡11～62歲；④患者及家屬均知情且自愿同意簽字。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有相關(guān)藥物過敏史；②除免疫抑制劑外還有特殊用藥史；③有未按要求服用規(guī)定藥物而影響療效判斷；④自身免疫性疾??；⑤有其他嚴(yán)重并發(fā)癥；⑥同一時間段已參加其他相關(guān)研究。觀察組男13例，女17例，年齡14～59歲[(28.76±4.53)歲]；對照組男14例，女16例，年齡15～61歲[(28.63±4.27)歲]。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意執(zhí)行。

1.2檢查方法治療前后分別抽取兩組患者外周靜脈血3 ml(肝素抗凝管)，檢測T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞的百分比，流式細(xì)胞儀型號EPICS?ALTRATM(美國貝克曼庫爾特有限公司)。使用肝素鈉充分抗凝并立即檢測，利用佛波酯及離子霉素聯(lián)合刺激淋巴細(xì)胞，并采用莫能霉素抑制高爾基體，通過胞內(nèi)抗體標(biāo)記來檢測胞漿內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平，每份標(biāo)本處理方式為：500 U肝素抗凝血+500 U 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)+PMA(50 ng/ml)+離子霉素(1 ng/ml)+莫能菌素(1.7 ng/ml)，孵育時間5小時，溫度37 ℃和5%CO2。刺激完成后標(biāo)記CD3-APC，室溫避光孵育30分鐘并用PBS洗滌后1%多聚甲醛固定，上機(jī)檢測。以流式細(xì)胞儀收集2×105個細(xì)胞，以CD3設(shè)們測定CD3陽性細(xì)胞的胞漿內(nèi)TNF-α和IFN-γ的表達(dá)百分率，每份標(biāo)本同時進(jìn)行同型對照的檢測。VEGF的表達(dá)檢測：采用原位雜交法。兩組標(biāo)本用固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(pH 7.2～7.6)室溫固定30分鐘蒸餾水充分洗滌，干燥后20 ℃保存。30%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化5～120秒。原位雜交PBS洗3次×5分鐘蒸餾水洗1次。后固定：固定液為1%多聚甲醛0.1 M PBS(pH 7.2～7.6)，室溫固定10分鐘，蒸餾水洗3次。預(yù)雜交：每張片子加20 U雜交液，放置專門蓋玻片，恒溫箱38～42 ℃雜交過夜。雜交后洗滌：不同濃度SSC液洗滌。滴加封閉液：37 ℃30分鐘甩去多余液體，不洗，依次滴加生物素化鼠抗地高辛(37 ℃、60分鐘)、SABC(37 ℃、20分鐘)、生物素化過氧化酶(37 ℃、20分鐘)，每次加藥前均用PBS洗5分鐘×4次。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒，1 m蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，加至標(biāo)本。顯色20～30分鐘充分水洗。必要時蘇木素復(fù)染，充分水洗后觀察。利用高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)，先于低倍鏡下全面觀察，VEGF陽性呈棕黃色顆粒狀，主要位于細(xì)胞質(zhì)。隨機(jī)觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率，取其平均值。

1.3觀察指標(biāo)測定T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞的百分比及CD3+淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)TNF-α和IFN-γ，并比較兩組治療前后相同部位骨髓涂片標(biāo)本中VEGF表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組免疫細(xì)胞變化情況比較治療后，觀察組T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞改善明顯優(yōu)于對照組(P< 0.05)，見表1。

表1 兩組免疫細(xì)胞變化情況比較 (%)

b與對照組比較，P< 0.05。

2.2兩組TNF-α、IFN-γ和VEGF表達(dá)比較治療后，觀察組CD3+/TNF-α+(%)、CD3+/IFN-γ+(%)和VEGF表達(dá)較對照組明顯下調(diào)(P< 0.05)，見表2。

表2 兩組TNF-α、IFN-γ和VEGF表達(dá)比較

a與對照組比較，P< 0.05

3 討論

AA是由多種因素引起的骨髓造血干細(xì)胞、造血微環(huán)境及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力改變，導(dǎo)致骨髓造血干細(xì)胞減少、造血功能衰竭，出現(xiàn)以全血細(xì)胞減少、進(jìn)行性貧血、出血、反復(fù)感染為主要臨床表現(xiàn)的綜合征[7]，AA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中免骨髓造血微環(huán)境損傷為其機(jī)制之一，故學(xué)者多以免疫介導(dǎo)造血抑制方面做研究[8，9]。其各種細(xì)胞因子及細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)為造血的免疫調(diào)節(jié)因素[10]，而部分AA患者存在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)制的異常，有研究認(rèn)為[11，12]其異?？赡芙槿朐煅杉?xì)胞的增殖和分化紊亂。而自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞被不同的刺激物激活而分泌的骨髓抑制性細(xì)胞因子有TNF-α和IFN-γ、IL-2，其中TNF-α和IFN-γ是最重要的造血負(fù)調(diào)控因子。有研究報道[13，14]，在體外造血抑制實驗中，TNF-α和IFN-γ能有效的抑制爆式紅細(xì)胞集落形成單位(BFU-E)的形成且AA患者IFN-γ的mRNA的檢出率顯著增高。但有關(guān)AA患者在臨床上有關(guān)淋巴細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)甚少。結(jié)合本研究顯示，AA患者外周血淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)TNF-α和IFN-γ的表達(dá)顯著高于對照組，證實AA患者有造血調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞因子平衡失調(diào)，造血負(fù)調(diào)控因子表達(dá)相應(yīng)增加，同國外學(xué)者觀點一致[15]。目前，臨床上主張采用免疫抑制治療AA患者，尤其是無骨髓移植適應(yīng)指征的AA患者，其有效率高達(dá)75%。結(jié)合本研究結(jié)果，在治療后，觀察組CD3+/TNF-α+(%)和CD3+/IFN-γ+(%)、VEGF的表達(dá)較對照組明顯下調(diào)。我們認(rèn)為治療后AA患者體內(nèi)T細(xì)胞的功能受到了抑制，造血負(fù)調(diào)控因子表達(dá)的水平降低，從而有助于骨髓造血功能的恢復(fù)和重建。

研究AA患者和經(jīng)免疫抑制治療后患者的CD3+T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)TNF-α和IFN-γ的表達(dá)改變，可為免疫抑制治療療效觀察提供早期的實驗依據(jù)。有學(xué)者研究認(rèn)為流式細(xì)胞術(shù)比運用ELISA法直接檢測血漿中TNF-α和IFN-γ濃度更具有細(xì)胞特異性，能客觀地檢測患者體內(nèi)特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的瞬時變化情況，因而更能反映免疫抑制藥物作用后的T淋巴細(xì)胞功能改變[16，17]。流式細(xì)胞術(shù)有可能成為再生障礙性貧血患者免疫抑制治療療效的檢測和早期預(yù)測指標(biāo)之一[18]。而VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，是屬于血小板源性生長因子，也是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂原[19，20]。VEGF在臨床上能在維持正常血管密度方面發(fā)揮積極作用且與生理性造血密切相關(guān)，而T淋巴細(xì)胞亞群屬于人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般腫瘤患者的免疫力低下多表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞減少、CD8+T細(xì)胞增加、CD4+/CD8+比值(表示機(jī)體的免疫狀態(tài))下降；NKT細(xì)胞屬于另外一類T細(xì)胞，在機(jī)體中重要的抗感染及抗腫瘤免疫等方面有的作用，NK細(xì)胞屬于機(jī)體重要的非特異免疫細(xì)胞。結(jié)合本研究觀察組VEGF水平明顯低于對照組，治療后明顯高于治療前，提示VEGF分泌減少與AA的發(fā)生或進(jìn)展有關(guān)。我們認(rèn)為損傷造血微環(huán)境，導(dǎo)致正常的血管密度難以維持，骨髓血管生成減少，造血基質(zhì)改變，血管通透性降低，骨髓局部血供、氧供減少，骨髓脂肪化加速，造血組織萎縮，從而影響生理性造血。VEGF維持造血干細(xì)胞的生存、分化和發(fā)育功能直接受影響，故VEGF在AA患者中呈低表達(dá)，其可從多方面影響骨髓血管生成和造血干細(xì)胞的生存，在AA發(fā)病機(jī)制中的具體作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，AA患者經(jīng)免疫抑制治療后可有效的減少胞漿內(nèi)的TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，且AA患者中VEGF呈現(xiàn)低表達(dá)現(xiàn)象。

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