唐 渝，姚 靜，馮小云，田 鯤，

(1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072)

早期形成的釉質(zhì)基質(zhì)幾乎全由蛋白質(zhì)組成，可分為釉原蛋白(amelogenin，Am)和非釉原蛋白(non-amelogenins)兩類，其中釉原蛋白占80%～90%，在釉質(zhì)成熟后則基本消失。人釉原蛋白由175個(gè)氨基酸組成，其序列主要由疏水殘基和親水C-末端構(gòu)成[1]，通常被劃分為三個(gè)區(qū)域：富含酪氨酸的N-末端序列；中央主要由X-Y-脯氨酸重復(fù)序列組成；由11個(gè)亮氨基酸殘基組成的親水性C-末端。

研究表明，釉原蛋白對(duì)牙釉質(zhì)的形成與礦化有著重要作用：作為鈣、磷等離子的儲(chǔ)存池，在形成羥基磷灰石(hydroxylapatite，HA)的過(guò)程中緩沖鈣離子[2]，并通過(guò)自組裝形成“納米球”聚集體；與羥基磷灰石和膠原都具有高親和性，控制組織結(jié)構(gòu)形成和釉質(zhì)礦化，最終被磷灰石礦物替代[3，4]。在體外研究中已經(jīng)證實(shí)釉原蛋白的礦化能力，但對(duì)其在體內(nèi)的作用還需要進(jìn)一步研究，同時(shí)由于RNA的選擇性剪接和蛋白水解處理會(huì)產(chǎn)生許多不同的、短鏈形式的釉原蛋白肽出現(xiàn)在發(fā)育中的釉質(zhì)中[5]，因此了解各個(gè)釉原蛋白肽的功能對(duì)透徹掌握釉原蛋白的生理特性至關(guān)重要。人類牙釉蛋白和其他動(dòng)物的釉原蛋白氨基酸序列間有較高的同源性，分析發(fā)現(xiàn)其在進(jìn)化上有同組聚類，但是聚類物種不同，水解片段在結(jié)構(gòu)和序列上有巨大物種間差異[1，3，5]，故而各物種牙釉質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)不盡相同。為了更準(zhǔn)確的模擬人類牙釉質(zhì)獨(dú)特的網(wǎng)球拍樣編制結(jié)構(gòu)，本研究鎖定人體釉基質(zhì)蛋白為模板，挑選因正畸目的需預(yù)防性拔除的發(fā)育期下頜第三磨牙，獲得成釉細(xì)胞功能活躍期分泌的釉原蛋白。對(duì)人釉原蛋白的研究為后續(xù)了解釉原蛋白功能片段在牙齒發(fā)育及礦化過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)牙齒脫礦乃至齲病后釉原蛋白在體內(nèi)引導(dǎo)羥磷灰石有序再礦化修復(fù)能力的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1人牙胚組織總RNA的提取完整取出2014年8月四川省人民醫(yī)院口腔正畸科兒童釉質(zhì)發(fā)育期下頜第三磨牙牙囊1例(圖1)，用Hank’s液漂洗后以液氮凍存，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂胕nvitrogen TRIZOL試劑提取[6]人牙胚的細(xì)胞總RNA，對(duì)總RNA 進(jìn)行濃度、純度檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

圖1 下頜第三磨牙的曲面體層像

1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的人釉原蛋白全長(zhǎng)序列(GenebankM86932)，利用分子生物學(xué)軟件Oligo 5.0和瑞典Pharmacia公司核酸分析軟件DNA SIS分析并設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)特異性引物Am-F/Am-R用于釉原蛋白全長(zhǎng)的擴(kuò)增，并分別在相應(yīng)引物上引入酶切位點(diǎn)Bam H I和Sac I。引物序列如表1，其中下劃線為酶切位點(diǎn)。由北京六合華大基因有限公司合成實(shí)驗(yàn)所用引物。

表1 釉原蛋白全長(zhǎng)引物

1.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈根據(jù)提取的人牙胚總RNA為模板，參考《分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[7]，采用M-MLV RTase進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如表2進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)合成cDNA第一鏈[8]。RNA于PCR儀70 ℃變性10分鐘；冰浴后加入6.8 μl混合物，PCR儀42 ℃1 h，90 ℃10 分鐘；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.4人釉原蛋白基因的擴(kuò)增及檢測(cè)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))采用25 μl體系擴(kuò)增人釉原蛋白基因，PCR反應(yīng)體系如表3.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察后拍照。

1.5人釉原蛋白全長(zhǎng)的回收切出凝膠電泳中目標(biāo)DNA片段所在條帶，切碎加PN溶液(每100 mg凝膠加300 μl PN溶液)，50 ℃加熱融化；溶液移至吸附柱后離心；取下吸附柱，棄廢液，加600 μl 漂洗緩沖液清洗，并重復(fù)一次。置超凈臺(tái)上晾置5 分鐘以去除漂洗緩沖液；將吸附柱置于新離心管，向柱子膜中央加入50 μl 60 ℃的洗脫緩沖液確保DNA完全溶解并洗脫，12000 rpm離心1分鐘，回收的DNA片段即在離心管的液體中，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表3 聚合酶鏈反應(yīng)體系

1.6人釉原蛋白基因的克隆構(gòu)建人釉原蛋白基因與pMD19-T(圖2)的重組質(zhì)粒，制備大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞于Luria-Bertani固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)12 h后觀察菌落。

圖2 pMD19-T載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.7重組克隆的篩選與鑒定從Luria-Bertani培養(yǎng)板上挑選白色菌落為重組陽(yáng)性菌落，液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)增菌，提取質(zhì)粒，收集DNA溶液按表4測(cè)序PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR鑒定。擇一經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆菌質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。ChromasPro軟件結(jié)果讀?。菏褂肗CBI上的Blast程序及軟件DNAMAN、Primer Premier5.0等進(jìn)行堿基序列比對(duì)分析。將測(cè)序鑒定正確的克隆菌命名為 pMD19-T-Am并保存。

表4 測(cè)序PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1人牙胚組織細(xì)胞總RNA提取的質(zhì)量分析經(jīng)過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280為1.99，A260/A230為2.08，表明提取的RNA質(zhì)量高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞總RNA的凝膠電泳結(jié)果如圖3，圖中RNA條帶清晰，28 S條帶約為18 S條帶亮度的2倍，無(wú)彌散帶，表明所獲得的RNA無(wú)明顯降解。

圖3 人牙胚細(xì)胞總RNA M：DM2000 maker；1：總RNA

2.2人釉原蛋白基因的擴(kuò)增以人牙胚RNA為模板，以Am-F/Am-R為引物擴(kuò)增釉原蛋白全長(zhǎng)基因并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)大小約為570 bp的特異性條帶，與預(yù)期一致，見(jiàn)圖4。

圖4 PCR擴(kuò)增釉原蛋白全長(zhǎng)基因 M：DM2000 maker；1：Am

2.3人釉原蛋白基因的質(zhì)粒鑒定將釉原蛋白基因與pMD19-T載體連接構(gòu)建質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，以Am-F/Am-R為引物進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。將鑒定的陽(yáng)性菌進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與NCBI公布的序列一致，表明獲得了釉原蛋白基因的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。

3 討論

成熟的牙釉質(zhì)是一種高度礦化的組織，其重量的96%～97%均為無(wú)機(jī)物，而發(fā)育中的釉質(zhì)則幾乎全由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中釉原蛋白約占90%[9]。隨后礦物質(zhì)在基質(zhì)中沉積，蛋白質(zhì)和水被吸收，如此交替反復(fù)長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，直至最后達(dá)到96%的礦化程度。在分泌期的釉基質(zhì)中常見(jiàn)到釉原蛋白自組裝形成的20 nm大小的“納米球”(nanospheres)超分子結(jié)構(gòu)，在釉質(zhì)晶體成核、生長(zhǎng)方向和速度調(diào)控上發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)挑選了出于正畸目的需預(yù)防性拔除下頜第三磨牙的正畸兒童，得到其釉質(zhì)形成期的下頜第三磨牙牙囊，此時(shí)正是成釉細(xì)胞分泌釉原蛋白最多的時(shí)候，能夠得到濃度較高的釉原蛋白。釉原蛋白在釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中由成釉細(xì)胞分泌，當(dāng)釉質(zhì)形成整個(gè)厚度后，成釉細(xì)胞的細(xì)胞器數(shù)量減少，體積縮小并變短。釉質(zhì)發(fā)育完成后，成釉細(xì)胞失去分泌釉原蛋白的功能，成為縮余釉上皮的一部分。研究發(fā)現(xiàn)，釉原蛋白可以控制晶體生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)羥基磷灰石(HAP)錯(cuò)綜復(fù)雜的微觀結(jié)構(gòu)[10]。

實(shí)驗(yàn)中提取高質(zhì)量的RNA是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的保障，因此對(duì)細(xì)胞總RNA的質(zhì)量檢測(cè)很有必要。純RNA樣品A260/A280的比值為1.7～2.1。經(jīng)過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，所提取的RNA 的A260/A280為1.99，A260/A230為2.08，提取的RNA質(zhì)量好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)GenBank公布的人釉原蛋白全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物并引入了限制性酶切位點(diǎn)便于克隆，從人牙胚組織中通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得釉原蛋白的編碼序列，通過(guò)PCR和凝膠電泳顯示所得到的條帶無(wú)彌撒帶，清楚單一。后與pMD19-T載體連接進(jìn)行TA克隆后篩選白色菌落并進(jìn)行測(cè)序鑒定，pMD19-T 載體是高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，其β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性較高，菌落所顯示的藍(lán)色更深且所需時(shí)間更短，克隆后更容易進(jìn)行克隆體的藍(lán)白篩選。使用NCBI上的Blast程序及軟件DNAMAN、Primer Premier5.0等對(duì)堿基序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與NCBI中的序列完全一致，證實(shí)已經(jīng)克隆了人釉原蛋白基因。為后續(xù)釉原蛋白基因功能片段的功能探索奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選取了處于釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中的人牙胚組織獲取細(xì)胞總RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得人釉原蛋白全長(zhǎng)基因，與pMD19-T 載體構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行克隆，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果表明初步獲得了人釉原蛋白基因的陽(yáng)性克隆載體，為后續(xù)在原核細(xì)胞中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

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