張 慧，姜 侃，厲永綱，胡小芳

（1.浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究院，浙江 杭州 310018；2.杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018）

雙酚A是一種有機化工原料，被廣泛用于食品包裝材料以提高容器的耐高溫、抗撞擊等性能。近年來有研究顯示，雙酚A進入身體后會導(dǎo)致動物或人體生殖系統(tǒng)的異常[1-2]、性早熟[3]、不育癥[4]等疾病。雙酚A的污染涉及水、土壤等的污染[5]，也可通過食品包裝或各種有機涂層遷移到食品中[6]，帶來食品安全隱患。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定雙酚A的限量為0.01 mg/L[7]；食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) GB 9685-2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，雙酚A用于食品接觸用涂料、涂層，以及食品接觸材料及制品用粘合劑中時，其特定遷移限量為0.6 mg/kg[8]。

雙酚A常用的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10]和酶聯(lián)免疫法[11]等。Minjoung Jo等人篩選出了雙酚A的單鏈寡核苷酸適配體[12]，并且有研究者利用核酸適配體的特異性識別作用，建立了雙酚A的納米金比色法[13]。

本文采用能特異性識別雙酚A的核酸適配體，制備基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條，并對試紙條的制備條件進行了優(yōu)化研究。為后續(xù)建立雙酚A快速檢測新方法奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品：98.5%；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：98%；Trition X-100 及其他試劑均為分析純；硝酸纖維素（NC）膜：Millipore HF13504，Sartorius CN140，MDI150CNPH-N-SS40；羧基熒光微球，99 nm；核酸序列由寶生物工程（大連）有限公司合成。

實驗中的核酸序列如下。

Aptamer：

5’-CCGGTGGGT GGT CAGGTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAAAAAA-NH2-3’

Test-Probe 1：

5’-TGG TGCGAA CCC GTG ATG CGC TGG GCC ATA CGC GGA ACG CTA TCC CAC CTG ACCACCCACCGG-Biotin-3’

Control-Probe 2：

5’-Biotin-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTT-3’

1.1.2 儀器

GA-FDS-003-04連續(xù)點膜儀；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；FD-1冷凍干燥機；Fics100熒光檢測儀。

1.2 方法

1.2.1 熒光微球的標(biāo)記

熒光微球使用0.1 mol/L NaH2PO4溶液（pH=6.2）稀釋，混勻。然后加入新配制的Sulfo-NHS（終濃度50 mg/mL）和EDC（終濃度50 mg/mL）混勻，37℃、1500 r/min反應(yīng)20 min。4℃離心，棄上層清液。再加入0.1 mol/L HEPES溶液（pH=7.3），混勻，加入 Aptamer（核酸：乳膠質(zhì)量比=100 μg/mg），混勻后37℃、1500 r/min反應(yīng)1.5 h。4℃離心，棄上層清液；加入2%乙醇胺溶液封閉，37℃，1500 r/min反應(yīng)40 min，離心，棄上層清液；加入乳膠保存液，4℃保存，備用。

1.2.2 C/T線溶液反應(yīng)方法（點膜）

將鏈霉親和素用 0.01 mol/L PBS（pH=7.4）稀釋成1 mg/mL，取5μL、1 mg/mL鏈霉親和素，與3.5 μL Control-probe 2（100 μmol/L）充分混合，加入31.5 μL、0.01 mol/LPBS（pH=7.4），37 ℃、1500 r/min反應(yīng)0.5 h；同理制備T線溶液；將C/T線溶液點在Millipore 13504的硝酸纖維素膜上，干燥備用。

1.2.3 樣本處理緩沖液和跑膜時間的選擇

將熒光微球與適配體的偶聯(lián)物10倍稀釋液噴灑于結(jié)合墊上，凍干。硝酸纖維素膜Millipore13504上僅劃線Test-Probe1，室溫陰干備用。不同樣本處理緩沖液：①10 mmol/L pH=8.0的Tris溶液（含 1%TX-100），②10 mmol/L pH=7.4的PBS溶液（含1%TX-100），分別點樣，熒光檢測儀在15 min、30 min時檢測所劃測試線的熒光信號強度。

1.2.4 硝酸纖維素膜（NC膜）干燥方式的選擇

將C/T線處理好的硝酸纖維素膜Millipore 13504，采用陰干干燥、37℃烘干進行比較研究，結(jié)合墊噴灑適配體和熒光微球的偶聯(lián)物，樣本處理緩沖液點樣，熒光檢測儀檢測。

1.2.5 不同硝酸纖維素膜的選擇

將C/T線處理好的硝酸纖維素膜Millipore 13504、Satorous、MID NC膜進行 37℃烘干處理，樣本處理緩沖液點樣，熒光檢測儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本原理

本研究是利用核酸適配體（aptamer）可以和雙酚A特異性結(jié)合的特性，并且基于競爭法檢測雙酚A的原理制備試紙條。試紙條中結(jié)合墊位置噴灑含有羧基的熒光微球與含有氨基的核酸適配體的偶聯(lián)物；檢測線（T線）位置為Test-Probe1，是與aptamer互補的核酸序列，可與aptamer中的有效序列發(fā)生反應(yīng)；控制線（C線）位置為Control-Probe 2，是一段與aptamer中連接臂互補的序列，可以捕獲連接臂。試紙條的顏色深淺與待測物質(zhì)含量成反比，待測物質(zhì)含量越高，T線顏色越淺，待測樣品不含待測物質(zhì)則T線顏色最深。

2.2 樣本處理緩沖液和跑膜時間的優(yōu)化

用熒光微球-適配體偶聯(lián)物制備試紙條，在NC膜上的中間位置僅劃T線，不同的樣本處理緩沖體系點樣，考察緩沖體系對測試信號強度的影響。檢測結(jié)果見圖1～4。

圖1 Tris樣本處理液跑膜15 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

圖2 Tris樣本處理液跑膜30 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

圖3 PBS樣本處理液跑膜15 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

圖4 PBS樣本處理液跑膜30 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

由圖1～圖4可知，使用熒光微球-適配體偶聯(lián)物制備試紙條，當(dāng)采用Tris樣本處理緩沖液時，15 min和30 min時T線位置 （信號位置200左右）均沒有熒光信號出現(xiàn)；當(dāng)使用PBS樣本處理液時，15 min時T線位置出現(xiàn)明顯的信號峰，信號強度達到150000以上；當(dāng)試紙條放置30 min時，信號位置沒有變化，信號峰依然保持，并且信號強度保持不變或略有增加。研究表明，PBS樣本處理緩沖液更適合熒光微球-適配體偶聯(lián)物的遷移。因此，選用PBS緩沖液用于后續(xù)研究，并將試紙條的反應(yīng)放置時間選擇為20 min。

2.3 硝酸纖維素膜（NC膜）干燥方式的選擇

在制備試紙條時，NC膜的干燥方式會對檢測信號產(chǎn)生一定的影響，圖5、圖6顯示了干燥方式對信號強度的影響。NC膜上劃有C線和T線，C線信號在位置100左右，T線信號在位置300左右。NC膜為Millipore HF13504。

圖5 NC膜干燥間陰干處理對檢測信號的影響（五條線為重復(fù)實驗）

圖6 NC膜37℃干燥處理對檢測信號的影響（五條線為重復(fù)實驗）

圖5 顯示NC膜在干燥間陰干處理時，多數(shù)實驗中C、T線信號較弱；NC膜37℃干燥處理時（圖6），5次重復(fù)實驗中C線、T線位置均出現(xiàn)了明顯的信號峰。因此，認(rèn)為NC膜37℃烘干處理更適合檢測體系。

2.4 不同硝酸纖維素膜的選擇

為進一步改善熒光檢測信號，對不同的硝酸纖維素膜進行了選擇，研究結(jié)果見圖6～圖8。NC膜上劃有C線和T線，C線信號在位置100左右，T線信號在位置300左右。

圖7 Satorous NC膜37℃干燥處理對檢測信號的影響（五條線為重復(fù)實驗）

圖8 MIDNC膜37℃干燥處理對檢測信號的影響（五條線為重復(fù)實驗）

圖6 ～圖8顯示，三種NC膜37℃干燥處理后，在C線、T線均有熒光信號出現(xiàn)，并且圖6中Millipore HF13504 NC膜C、T線熒光信號較強；紫外燈下肉眼觀察，均可見熒光條帶，Millipore NC膜上的熒光條帶較亮。因此，后續(xù)實驗選擇Millipore HF13504NC膜，37℃干燥處理來制備試紙條。

2.5 試紙條的制備

采用優(yōu)化的條件，制備基于適配體的雙酚A的熒光檢測試紙條，經(jīng)不含待測物質(zhì)樣品（空白樣本緩沖溶液）跑膜，C線、T線均出現(xiàn)明亮的熒光條帶，見圖9。該試紙條可用于雙酚A快速檢測方法的進一步研究。

圖9 制備的基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了雙酚A熒光檢測試紙條的部分制備條件，結(jié)果顯示：采用PBS樣本處理緩沖液、跑膜時間為20 min、硝酸纖維素膜37℃干燥2 h、硝酸纖維素膜為Millipore HF13504等優(yōu)化條件，制備的基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條，樣品中不含待測物質(zhì)時，C線、T線均有明亮的熒光條帶出現(xiàn)。該試紙條可用于基于競爭原理的雙酚A快速檢測方法的后續(xù)研究，為雙酚A快速檢測新方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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