魯海菊， 張曉永， 江 濤， 胡金碧， 田學(xué)軍

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199)

隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，大規(guī)模連片種植單一作物導(dǎo)致土壤連作障礙日漸突顯，土傳病害是導(dǎo)致土壤連作障礙的重要因素之一，而引入拮抗菌是生物防治連作障礙的措施之一[1]。木霉(Trichoderma)是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，曾成功防治辣椒白絹病和猝倒病[2]、黃瓜枯萎病[3]、辣椒疫病[4]等多種土傳病害。雖然野生型木霉菌株對植物病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，但在田間其防效會大幅度下降，其主要原因是木霉在根際土壤中定殖受到各種環(huán)境因素的影響，很難成功定殖。有學(xué)者曾用紫外線誘變方法獲得強(qiáng)根際能力的木霉菌株[5]。眾多學(xué)者研究表明，在植物體內(nèi)存在內(nèi)生木霉，在可可[6]、茶樹[7]、蘆竹[8]、南方紅豆杉[9]等植物中成功分離到內(nèi)生木霉。其中，在蘆竹和南方紅豆杉中分離的木霉分別對煙草赤星病和水稻紋枯病有很好的防治效果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，從其他地方分離的木霉菌株也能在可可莖上定殖，與其形成共生關(guān)系，最終成為宿主的內(nèi)生真菌[10]。說明不管是本地的內(nèi)生木霉還是從外界引入的木霉，均能與宿主形成共生關(guān)系，最終成為宿主的內(nèi)生真菌，對宿主有促生、抗病等作用[11]。內(nèi)生木霉受到寄主植物的良好保護(hù)，并能獲得足夠的碳、氮源供其自身生長。因此，內(nèi)生木霉比其他腐生的木霉更易于發(fā)揮生防作用。筆者從枇杷主干韌皮部中分離到1株內(nèi)生木霉P3.9菌株，它對枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsissp.)[12]、康乃馨根腐病病菌(Fusariumsp.)[12]、辣椒黃萎病病菌(Verticilliumsp.)[12]、萬壽菊葉斑病病菌(Alternariasp.)[12]、石榴干腐病病菌[13]等均具有強(qiáng)烈的抑制作用，能成功定殖于枇杷主干及黃瓜根、莖、葉中，并具有固氮、抗化學(xué)農(nóng)藥、降解難溶性磷酸鹽、降解纖維素等多種功能[14]。可見，內(nèi)生木霉P3.9菌株具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。因此，對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，可為進(jìn)一步開發(fā)其應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 筆者從枇杷主干韌皮部組織分離內(nèi)生真菌，經(jīng)枇杷根腐病菌對峙培養(yǎng)篩選，獲得抗枇杷根腐病病菌的木霉P3.9菌株(Trichodermasp.)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，簡稱PDA；配方為200 g馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g 瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(potato saccharose agar，簡稱PSA；配方為200 g馬鈴薯、16 g蔗糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL 蒸餾水)、玉米瓊脂培養(yǎng)基(maize agar，簡稱MA；配方為30 g 玉米、17 g瓊脂粉、1 000 mL 蒸餾水)、小麥瓊脂培養(yǎng)基(wheat agar，簡稱WA；配方為30 g小麥、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、枇杷瓊脂培養(yǎng)基(loquat agar，簡稱LA；配方為200 g枇杷葉、20 g 瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(carrot agar，簡稱CA；配方為200 g胡蘿卜、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、查貝氏(Czapek’s)培養(yǎng)基(配方為2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸二氫鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g七水硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g 蔗糖、20.00 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 碳源(葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、D-甘露醇)、氮源(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨)。上述材料均購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 將內(nèi)生木霉P3.9菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為 5 mm 的菌絲塊，同時(shí)接種于PDA、PSA、MA、WA、CA、LA等6種培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，5 d 后采用十字交叉法[15]測定其菌落直徑。

1.2.2 碳、氮源對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以查貝氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳(葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、D-甘露醇)和氮(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨)替換蔗糖和硝酸鈉，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.3 溫度對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在溫度為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，菌株接種及菌落直徑測量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.4 pH值對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1%鹽酸、0.1%氫氧化鈉將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.5 光照對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光—暗交替(12 h—12 h)、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.6 不同濕度對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在50%、60%、70%、80%、90%、100%濕度條件下，28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)5 d，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.7 不同營養(yǎng)液對內(nèi)生木霉P3.9孢子萌發(fā)的影響 用2%葡萄糖、2%蔗糖、2%蛋白胨、2%葡萄糖+1%蛋白胨、2%蔗糖+1%蛋白胨配制1×106個(gè)/mL P3.9菌株木霉孢子液，取0.2 mL涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng) 18 h 后觀察。

1.2.8 內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子的致死溫度 用無菌水配制1×106個(gè)/mL木霉P3.9菌株孢子液，放入離心管中，在溫度為40、45、50、52、55 ℃條件下水浴10 min，在28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)18 h后觀察孢子的萌發(fā)情況。以上所有配制好的培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋于121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan’s多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表1可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株在不同培養(yǎng)基上均能正常生長，具有較強(qiáng)的營養(yǎng)適應(yīng)性。內(nèi)生木霉P3.9菌株在PDA培養(yǎng)基上生長的菌落直徑與在其他培養(yǎng)基上生長的菌落直徑相比差異極顯著，菌落直徑最大，說明PDA培養(yǎng)基最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長。

表1 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著，下表同。

2.2 不同碳源對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表2可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株在不同碳源培養(yǎng)基上均能正常生長，具有較強(qiáng)的碳源適應(yīng)性。相比較而言，蔗糖中的菌絲生長菌落直徑與其他碳源差異極顯著，菌落直徑最小(除無碳源對照外)，說明蔗糖不適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長，而其他6種供試碳源均適合其菌絲生長。由圖1可知，D-果糖產(chǎn)孢量最多，因此D-果糖最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株產(chǎn)孢。

表2 不同碳源對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.3 不同氮源對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表3可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株在不同氮源培養(yǎng)基上均能正常生長，具有較強(qiáng)的氮源適應(yīng)性。在磷酸二氫銨中生長的內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑與其他6種供試氮源相比，差異極顯著，菌落直徑最大，說明磷酸二氫銨最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長。另外觀察可知，銨態(tài)氮適合內(nèi)生木霉P3.9菌株產(chǎn)孢(圖2)。

表3 不同氮源對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.4 不同溫度對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表4可知，在溫度為10～35 ℃之間，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均能正常生長，在15～30 ℃之間內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑分別與其他溫度處理差異極顯著，菌落直徑較大，說明在15～30 ℃范圍內(nèi)最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長。由圖3可知，與溫度為25、30 ℃處理相比，在28 ℃條件下內(nèi)生木霉P3.9菌株產(chǎn)孢量較多，適合產(chǎn)孢。

表4 不同溫度對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.5 不同pH值對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表5可知，在pH值為3～10時(shí)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均能正常生長，菌落直徑差異不顯著，均達(dá)到90.0 mm，具有較強(qiáng)的pH值適應(yīng)性。由圖4可以看出，pH值為10時(shí)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲直徑最大，產(chǎn)孢量最多。

表5 不同pH值對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.6 光照對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表6可知，在光暗交替(12 h—12 h)、全黑暗和全光照3種光處理下，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑差異不顯著，菌落直徑均達(dá)到90.0 mm，說明光照并不影響菌絲生長。其中，光暗交替最適合其產(chǎn)孢(圖5)。

表6 光照對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.7 不同濕度對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表7可知，在不同濕度下內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑差異不顯著，菌落直徑均達(dá)到90.0 mm，說明濕度不影響內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長。

表7 不同濕度對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.8 不同營養(yǎng)液對內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)的影響

由表8可知，與清水對照相比，不同配比的葡萄糖、蔗糖和蛋白胨溶液對內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)率影響差異極顯著，說明內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)受葡萄糖、蔗糖和蛋白胨溶液的影響，其中2%蛋白胨溶液極顯著促進(jìn)內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)，2%葡萄糖和2%蔗糖溶液則極顯著抑制孢子萌發(fā)。

表8 不同營養(yǎng)液對內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)的影響

2.9 內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子致死溫度

由表9可知，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h，不同溫度水浴處理的內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)率差異明顯，在52、55 ℃ 2種處理中，內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子的萌發(fā)率為0，兩者間無顯著差異，因此選擇52 ℃作為內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子的致死溫度(圖6)。

表9 內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子致死溫度

3 結(jié)論與討論

生物學(xué)測定結(jié)果表明，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株最適合的培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基、碳源為D-果糖、氮源為磷酸二氫銨、溫度為28 ℃、pH值=10、光暗交替；2%蛋白胨溶液能極顯著提高內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)率，孢子致死溫度為 52 ℃，銨態(tài)氮適合產(chǎn)孢。D-果糖、葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖和D-甘露醇5種碳源之間對內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長差異不顯著，但D-果糖產(chǎn)孢量最多，因此D-果糖為最適合碳源；在15～30 ℃范圍內(nèi)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均可以獲得正常生長，但28 ℃適合產(chǎn)孢，因此產(chǎn)孢最佳溫度為 28 ℃；pH值在3～10范圍內(nèi)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均可以正常生長，但pH值=10適合產(chǎn)孢，因此pH值=10為最佳酸堿度；光照不影響菌絲生長，但能促進(jìn)產(chǎn)孢，光暗交替產(chǎn)孢量最大，因此光暗交替最適合P3.9木霉菌株生長。

在楊樹枝干上分離的T88木霉菌株最佳培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基、碳源為果糖、溫度為30 ℃，光照有利于產(chǎn)孢[16]，銨是木霉菌最易利用的氮源[17]，與本研究結(jié)論基本一致。分離自菜園土中的綠色木霉HT-01菌株的最佳酸堿度為5[18]，與本研究結(jié)論不一致，導(dǎo)致該差異的原因可能是2個(gè)菌株之間小生境不一致，枇杷屬于堿性果樹，在其中生長的木霉菌株長期適應(yīng)堿性環(huán)境，因此偏堿性更適合其生長。這也是內(nèi)生菌與寄主相互適應(yīng)、協(xié)調(diào)進(jìn)化[19]的又一個(gè)例證。1%葡萄糖溶液促進(jìn)木霉菌Tr 970菌株孢子萌發(fā)，致死溫度為55 ℃(15 min)[20]，與本研究結(jié)論不一致。在15～40 ℃范圍內(nèi)長枝木霉TICC菌株能生長產(chǎn)孢，在35 ℃時(shí)菌絲生長最快[21]，與本研究結(jié)論不一致。說明不同木霉菌株生長溫度范圍變化幅度較大，內(nèi)生木霉P3.9菌株生長溫度范圍為15～30 ℃，在溫度為10、35 ℃條件下菌絲雖能生長，但速度很慢，由此推測內(nèi)生木霉P3.9菌株只適合應(yīng)用在晝夜溫差及季節(jié)溫差不大的南方。

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