劉娜 張賢華 李影 張維 楊坤 顧斌

隨著增齡的變化，人體多種重要器官由于干細(xì)胞維持組織平衡能力下降，出現(xiàn)衰老相關(guān)疾病表現(xiàn)，與人體大部分組織器官一樣，骨具有發(fā)育、增齡、衰老的過(guò)程和受損后的再生能力，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨組織代謝或骨改建的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1]。在骨發(fā)育、衰老和再生修復(fù)中干細(xì)胞起到了主導(dǎo)作用，同時(shí)干細(xì)胞的各項(xiàng)功能受到嚴(yán)密的分子調(diào)控，這些調(diào)控因素不僅是維持骨生理性功能活動(dòng)的基礎(chǔ)，而且是決定病理狀態(tài)產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的機(jī)制。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)在骨骼的發(fā)育和代謝方面有重要作用。近年來(lái)的研究提示，Wnt信號(hào)通路與干細(xì)胞的增齡變化有密切關(guān)系，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老發(fā)揮重要調(diào)控作用[2]，也有研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生ROS進(jìn)而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老[3]。除此之外，機(jī)體的生理、病理狀態(tài)發(fā)生改變會(huì)改變干細(xì)胞所處的微環(huán)境，進(jìn)而影響干細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)通路的活化水平[4-7]。本研究采用不同年齡大鼠來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)探討增齡因素導(dǎo)致的體內(nèi)環(huán)境改變對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。

1.材料方法

1.1 材料 胎牛血清，L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)；0.25%胰蛋白酶(Sigma,St Louis,MO,美國(guó))；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國(guó)Life Technologies公司)；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國(guó))；Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物上海生物工程公司(中國(guó))；Syber Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(Takara，日本)；衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，Westen及IP裂解液，核蛋白提取液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司，中國(guó))；IL-6、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒(R&DSystems，美國(guó))；β-catenin(Abcam，美國(guó))；β-Act in，羊抗兔IgG(中杉金橋，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡級(jí)18月齡SD大鼠共16只，均為雄性大鼠，每組各8只，平均體重(590±17)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。各月齡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，取雙側(cè)股骨，每個(gè)樣本取單側(cè)股骨-80℃冰箱保存待查，另一側(cè)股骨進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 骨密度測(cè)定 采用Discovery Wi(Hologic，美國(guó))雙能X線骨密度儀對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的股骨樣本進(jìn)行骨密度測(cè)定。首先將骨組織樣本放置在骨密度儀探頭下，應(yīng)用動(dòng)物骨密度測(cè)定軟件，自動(dòng)分析出大鼠股骨的骨密度。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定遵循本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)步驟[6]。3月齡及18月齡SD大鼠各8只，脫頸處死，消毒后取下股骨，無(wú)菌去除骨組織周圍肌肉及筋膜等軟組織，暴露骨髓腔。用注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，將所得懸液以1500r/min離心5min。重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)基(90%L-DMEM和10%胎牛血清)，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后半量換液，3d后鋪滿瓶底80%時(shí)傳代。采用低密度稀釋法擴(kuò)增培養(yǎng)獲取BMSCs,取3-4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal染色) 將純化獲取的P3代BMSCs制成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)／mL的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)50%。按衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)說(shuō)明首先將細(xì)胞用β-半乳糖苷酶固定劑固定10min，PBS洗滌三次(每次3min)后，隨后用新鮮制備的β-半乳糖苷酶的染色工作液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，37℃放置12h，隨機(jī)選擇10個(gè)微觀領(lǐng)域的陽(yáng)性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA檢測(cè))將P3代BMSCs按1×105個(gè)/mL的密度接種到24孔板中，每孔800ul，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗1遍，換新鮮的L-DMEM(10%FBS)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，72h后收集各個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，離心后取上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。按照TNF-α、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后每孔加入待測(cè)樣品100μl，洗板，每孔加入一抗工作液50μl反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min，洗板，加入酶標(biāo)抗體工作液100μl反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min，洗板后加入底物液100μl，置于37℃避光反應(yīng)10min，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測(cè)吸光值。

1.7 Western blotting檢測(cè)BMSCs中的蛋白表達(dá) 將P4代3月齡及18月齡BMSCs以2×105個(gè)/mL的密度接種于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)72h細(xì)胞密度達(dá)70%，在預(yù)冷的PBS中清洗3遍，采用細(xì)胞裂解液試劑盒分別提取各組標(biāo)本中的總蛋白，另外根據(jù)實(shí)際說(shuō)明應(yīng)用細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒分離提取BMSCs細(xì)胞核蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白樣本濃度，沸水煮5min，12000r/min離心1min，制備蛋白樣品，－20℃保存。配置8%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS電泳液，依據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓至 120V，電泳 60min。在轉(zhuǎn)移電泳槽(200mA，2h)中將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF)膜，用 TBST配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液封閉2h，PVDF膜封閉β-catenin(1∶800)，4℃過(guò)夜。次日取出封有一抗的PVDF膜，用TBST洗膜，每次5min，共計(jì)3次。按說(shuō)明書加入1∶1000工作濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共計(jì)3次。漂洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，采用蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)BMSCs基因表達(dá)將2組P4代BMSCs以1×105個(gè)/mL的密度接種至T25培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁后PBS沖洗兩遍，隨后換液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，72h后用Trizol裂解并提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系均為20μl。引物序列：TERT：Forw ard 5’-CTAGCATCCTGCTGCTACGC-3’，Reverse 5’-AGGGGACAGGGTTAGTCCAA-3’； LEF-1：Forward 5’-TCAGGCAAGCCTACCCATCTTC-3’，Reverse5’-GGGTGCTCCTGTTTGACCTGA-3’；TCF-4：Forward 5’-TCCCAGTACTACC CATATTCCAGCA-3’，Reverse 5’-AGTCCCTG TTGTAGTCGGCAGTG-3’；β-Actin：Forward 5’-GGGTCCTCTGTGAACTTGCTC-3’，Reverse 5’-TGTAATCCTGTGGCTTGTCCTC-3’。反應(yīng)條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)計(jì)算后得出。驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；進(jìn)行多組間比較時(shí)，P值進(jìn)行Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大鼠股骨密度測(cè)定結(jié)果 雙能X線檢測(cè)結(jié)果顯示隨著年齡的增殖大鼠股骨密度顯著降低。我們所檢測(cè)的3月齡雄性大鼠股骨密度為0.394±0.0491g/cm2,18月齡雄性大鼠股骨密度為0.2540±0.0437g/cm2，其顯著低于3月齡組(P＜0.05，圖1)。

圖1 大鼠股骨密度檢測(cè)(*P＜0.05)

2.2 SA-β-Gal染色檢測(cè)BMSCs增齡性變化將3月齡及18月齡大鼠BMSCs均勻接種，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞密度達(dá)到80%后進(jìn)行SA-β-Gal染色。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，胞突略短，胞漿飽滿，細(xì)胞狀態(tài)良好。此外，2組均可見BMSCs成功染色，淺藍(lán)色為陽(yáng)性，3月齡組少數(shù)細(xì)胞染色陽(yáng)性，18月齡組細(xì)胞染色陽(yáng)性數(shù)目較多(圖2A)。隨后我們將染色后細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比，經(jīng)10個(gè)視野的綜合統(tǒng)計(jì)分析可見18月齡BMSCs SA-β-Gal染色陽(yáng)性率高達(dá)37.902%，顯著高于3月齡組BMSCs(P＜0.05，圖2B)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BMSCs的衰老程度，我們從基因水平檢測(cè)了TERT的表達(dá)，結(jié)果顯示18月齡BMSCs表達(dá)量顯著低于3月齡組(P＜0.05，圖2C)。

圖2 3月齡及18月齡BMSCs SA-β-gal染色結(jié)果及TERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.3 增齡因素對(duì)BMSCs炎癥因子分泌量的影響 將3月齡及18月齡大鼠P3代BMSCs種到24孔板中，細(xì)胞貼壁72小時(shí)候提取細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。在提取的細(xì)胞外基質(zhì)中均檢測(cè)到了炎癥因子TNF-α及IL-6。檢測(cè)結(jié)果顯示18月齡大鼠BMSCs所分泌的TNF-α(P＜0.05，圖3A)及IL-6(P＜0.05，圖3B)均顯著高于3月齡BMSCs的炎癥細(xì)胞因子分泌量。

圖3 3月齡及18月齡大鼠BMSCs培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌量

2.4 增齡因素對(duì)大鼠BMSCs Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 由于Wnt信號(hào)通路骨發(fā)育及骨再生中發(fā)揮重要作用，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上我們對(duì)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白及基因進(jìn)行檢測(cè)。首先我們分離提取3月齡及18月齡BMSCs的全細(xì)胞蛋白并進(jìn)一步分離提取了細(xì)胞核蛋白。分別將3月齡及18月齡BMSCs的全細(xì)胞蛋白及細(xì)胞核蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示18月齡BMSCs無(wú)論全細(xì)胞蛋白還是細(xì)胞核蛋白的表達(dá)量均高于3月齡BMSCs組(圖4A)。Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示W(wǎng)nt通路關(guān)鍵基因LEF-1及TCF-4在18月齡大鼠BMSCs中的表達(dá)顯著高于3月齡BMSCs組(P＜0.05，圖4B)。

圖4 3月齡及18月齡大鼠BMSCs常規(guī)培養(yǎng)72h后β-catenin蛋白的表達(dá)量及LEF-1、TCF-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3.討論

干細(xì)胞在機(jī)體中處于一種平衡狀態(tài)，但是隨年齡的增長(zhǎng)，干細(xì)胞的功能受到一定影響，其平衡遭到破壞。機(jī)體增齡過(guò)程中，間充質(zhì)干細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生改變，從而使其某些生物學(xué)性狀不再穩(wěn)定，主要表現(xiàn)為自身抵抗力的降低及其對(duì)外界環(huán)境刺激的反應(yīng)能力的降低。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨骼發(fā)育和重建過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，前期有文獻(xiàn)報(bào)道隨著小鼠年齡的增加BMSCs的增殖能力及成骨分化能力均受顯著抑制[8]。另有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力隨著年齡增長(zhǎng)或分裂次數(shù)的增加而下降，來(lái)自老年供體的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力和抗凋亡能力均低于年輕供體來(lái)源的細(xì)胞[9]。

由于前期研究證實(shí)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后間充質(zhì)干細(xì)胞可能在基因表達(dá)、增殖和分化能力等方面發(fā)生變化甚至發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[10]，因此，本研究采用的是收集不同年齡階段大鼠的股骨骨髓進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行增齡因素對(duì)大鼠BMSCs的影響及可能的機(jī)制。首先我們通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增殖大鼠股骨密度顯著降低，在此基礎(chǔ)上我們?cè)龠M(jìn)一步進(jìn)行干細(xì)胞衰老情況的鑒定。SA-β-Gal是被廣泛認(rèn)可的經(jīng)典細(xì)胞衰老標(biāo)記物之一[11]，因此我們應(yīng)用衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色試劑盒對(duì)兩組BMSCs的SA-β-Gal的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，染色結(jié)果顯示兩組BMSCs均有藍(lán)色沉淀形成，但是18月齡組BMSCs藍(lán)色沉淀的數(shù)量、面積等顯著高于3月齡組，這也與前期的報(bào)道一致[11]。端粒相對(duì)長(zhǎng)度和端粒酶活性也是細(xì)胞增齡和衰老的重要指標(biāo)，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，是以自身RNA為模板，合成端粒重復(fù)序列，加到新合成DNA鏈末端。因此，細(xì)胞每有絲分裂一次，就丟失一段端粒序列，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短至一定程度，細(xì)胞停止分裂導(dǎo)致衰老與死亡。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)起源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，在其他輔助酶作用下利用RNA合成DNA，TERT是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)控亞單位，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄端粒酶R NA模板序列，合成端粒DNA重復(fù)序列并添加到染色體末端，從而延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度[12]。本課題應(yīng)用 qRT-PCR對(duì)兩組BMSCs的端粒酶mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果顯示18月齡BMSCs TERT表達(dá)量顯著低于3月齡BMSCs組。

前期研究表明隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體功能在逐漸發(fā)生變化，當(dāng)增齡性變化達(dá)到衰老程度時(shí)，天然免疫被激活并產(chǎn)生促炎介質(zhì)，炎癥因子的水平會(huì)呈現(xiàn)不同程度的升高[13]。近期研究證實(shí)衰老與炎癥是相互作用的，衰老過(guò)程常伴隨炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，而炎癥又可導(dǎo)致衰老的發(fā)生發(fā)展[14]。我們通過(guò)將3月齡及18月齡大鼠BMSCs所分泌的TNF-α及IL-6進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果證實(shí)隨著年齡的增長(zhǎng)BMSCs所分泌的細(xì)胞因子的水平顯著增高，這些結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，表明增齡性變化會(huì)引起機(jī)體免疫水平的改變，使其炎癥因子表達(dá)增高進(jìn)而使機(jī)體各器官產(chǎn)生衰老相關(guān)表型。在增齡性骨代謝過(guò)程中骨質(zhì)及骨量都會(huì)隨著年齡的增加而減少，炎癥因子水平的升高會(huì)直接影響骨髓腔的微環(huán)境，TNF-α及IL-6水平的長(zhǎng)期持續(xù)增高可以導(dǎo)致干細(xì)胞成骨分化能力的降低，并抑制干細(xì)胞的骨再生潛能。闡明增齡性骨代謝異常的作用機(jī)制并探尋增強(qiáng)增齡性BMSCs成骨分化能力是近期研究的熱點(diǎn)。

Wnt家族蛋白是體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)蛋白，參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、干細(xì)胞自我更新及腫瘤發(fā)展過(guò)程，同時(shí)在維持骨穩(wěn)態(tài)中也起到重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道Wnt3a+/-雄性小鼠骨質(zhì)含量較正常下降[15]。另有研究表明Wnt經(jīng)典信號(hào)通路抑制成骨作用的原因是成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平降低以及抑制在成骨過(guò)程中發(fā)揮重要作用的c-JNK以及P38MAPK，Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的高表達(dá)能夠抑制hMSC形成新生骨[16]。在骨髓微環(huán)境中，β-catenin需要長(zhǎng)期的表達(dá)來(lái)維護(hù)原始造血細(xì)胞的能力[17]。本研究中我們分別提取了3月齡及18月齡大鼠BMSCs的全細(xì)胞蛋白及細(xì)胞核蛋白，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著年齡的增加細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin聚積量顯著增高，全細(xì)胞蛋白中的β-catenin表達(dá)水平也呈上升趨勢(shì)，這提示W(wǎng)nt經(jīng)典信號(hào)通路的激活是增齡性骨代謝異常的重要因素。另外，經(jīng)典Wnt通路通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF和FOXO與β-catenin特異性關(guān)聯(lián)從而影響老化過(guò)程。這些轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)水平以及它們?cè)诤藘?nèi)的定位與細(xì)胞老化密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)不同的wnt通路水平調(diào)控著老化過(guò)程。當(dāng)β-catenin與TCF/LEF結(jié)合時(shí)，可以減緩老化；當(dāng)β-catenin與FOXO結(jié)合時(shí)，可以加速細(xì)胞衰老[18]。此外，已經(jīng)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin與 TCF/LEF結(jié)合后可啟動(dòng) Runx2、c-myc、cyclinD等靶基因，促使細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、發(fā)育與成熟。本研究的qRT-PCR結(jié)果顯示，18月齡組BMSCs隨著細(xì)胞核內(nèi)β-catenin聚積量增高Wnt經(jīng)典信號(hào)通路被激活，細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子LEF-1、TCF-4的表達(dá)水平顯著增高，這兩種轉(zhuǎn)錄因子的增高會(huì)影響B(tài)MSCs的增殖能力。

本研究通過(guò)對(duì)比研究不同年齡階段BMSCs的炎癥細(xì)胞因子分泌水平及Wnt經(jīng)典信號(hào)通路關(guān)鍵基因及蛋白的變化，探索增齡因素影響下BMSCs生物學(xué)行為異常的發(fā)生機(jī)制。在機(jī)體的增齡至衰老過(guò)程中其表觀遺傳的變化，如干細(xì)胞數(shù)量的變化、自我更新及增殖能力的變化、多項(xiàng)分化潛能的變化對(duì)其有一定的影響，在這個(gè)過(guò)程中干細(xì)胞所處的微環(huán)境變化發(fā)揮同樣重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)機(jī)體的炎癥因子表達(dá)水平會(huì)有所增高，這也是干細(xì)胞功能變化的重要干擾因素，此外還發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在此過(guò)程中發(fā)生明顯變化，基于此后期我們將系統(tǒng)研究增齡導(dǎo)致干細(xì)胞功能變化的作用機(jī)制，為提高增齡條件下干細(xì)胞增殖及成骨分化能力提供理論依據(jù)。

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