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(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

褪黑素(melatonin，MT)最早在1958年從牛松果體中分離得到的一種短半衰期的小分子神經(jīng)遞質(zhì)，化學名N-乙?；?5甲氧基色胺，是一種高度雙親性(親脂性和親水性)吲哚胺類化合物，由于其代謝產(chǎn)物2-羥基褪黑素、N-乙?；逅亍?-甲氧基色胺等均具有較強抗氧化性，故認為MT具有級聯(lián)抗氧化效應(yīng)。在動物和人體中具有提高睡眠質(zhì)量、提高機體免疫力、抗氧化、抗凋亡、延緩衰老、抑制腫瘤細胞生長等多種藥理功能[1-3]。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，1995年首次在植物的果實、莖和葉等器官均發(fā)現(xiàn)MT的存在，以植物種子中含量最高，在植物體中發(fā)揮著調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和光周期、調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抗生物和非生物逆境(重金屬、鹽害、病原菌等)等生理作用[4]。研究表明，光合細菌細胞中MT能夠保護光合作用色素，釀酒酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的MT可以上調(diào)SOD、CAT、GPX的活性和硫氧還蛋白基因表達水平，增強酵母在過氧化氫、UV等脅迫時的抵御能力[5-7]。

研究表明，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的水楊酸、乙烯、茉莉酸和一氧化氮等物質(zhì)均可激活靈芝酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達，誘導靈芝酸的生物合成[8-10]。既然植物MT與水楊酸、生長素和一氧化氮等植物激素存在著一定的互作與對話，那么MT可能具有誘導靈芝菌絲體產(chǎn)生靈芝酸的作用[11]。本文在靈芝菌絲體發(fā)酵的對數(shù)生長期添加MT作為誘導劑，研究了MT對抗癌劑靈芝酸誘導作用的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)，初步探索MT在真菌靈芝中的生物功能，以期提高靈芝酸產(chǎn)量，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝菌種(Ganodermalucidum)由上海農(nóng)科院食用菌研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

756-MC型可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；YXQ-LS50S11立式壓力蒸汽滅菌器(上海云泰儀器儀表有限公司)；HZ-300 L恒溫搖床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司)；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；XHF-D高速分散器等(寧波新芝生物科技股份有限公司)。乙醇(分析純，合肥工業(yè)大學化學試劑廠)；熊果酸、高氯酸、香草醛、冰乙酸、蛋白胨均為分析純(國藥試劑公司)。

1.3 菌種培養(yǎng)與處理

靈芝菌種在斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂 15 g/L)中保存；接種至種子液培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L)培養(yǎng)種子液；接種在液體培養(yǎng)基(KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、葡萄糖20 g/L、玉米粉4 g/L、蛋白胨10 g/L)進行發(fā)酵，接種量5%；250 mL三角錐形瓶中裝液量100 mL；28 ℃，150 rpm，培養(yǎng)時間依試驗需要確定。

1.4 生物量測定

發(fā)酵液在6 000 rpm 離心10 min，棄上清，將沉淀于-50 ℃真空冷凍干燥至恒重，稱重。

1.5 標準曲線

準確稱取熊果酸標準品5.0 mg，溶于乙酸乙酯定容至50.0 mL容量瓶中，混勻得熊果酸標準溶液(100 mg/L)。分別取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL熊果酸標準溶液置于帶蓋試管，加熱揮去溶劑，加入現(xiàn)配制的0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，在65 ℃加熱15 min，冷卻至室溫，加入5.0 mL冰乙酸，搖勻靜置15 min，于547.5 nm測定吸光值，標準曲線為：y=0.008 8X+0.079 7(R2=0.998 2)。

1.6 靈芝酸提取與測定

稱取干燥菌絲體0.1 g，加入10 mL乙醇，常溫超聲波3 h，6 000 rpm離心20 min，取上清液5 mL，重復(fù)浸提3次，合并上清液。根據(jù)標準曲線法測定靈芝酸含量，并計算其產(chǎn)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2007；統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對深層發(fā)酵靈芝菌絲體生物量、靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

圖1 不同濃度褪黑素對靈芝菌絲生物量(A)、靈芝酸含量(B)和靈芝酸產(chǎn)量(C)的影響

種子液擴大培養(yǎng)至第3天時添加除菌的不同濃度褪黑素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天收獲菌絲體。由圖1A可知，褪黑素濃度為10、20、30、50、100 μmol/L試驗組菌絲體生物量均高于對照組，其中50 μmol/L試驗組菌絲體生物量為7.91 g/L。由于褪黑素濃度為20 μmol/L時，靈芝酸含量與靈芝酸產(chǎn)量均達到最大值，分別為32.29、244.53 mg/L(圖1B、1C)，故優(yōu)選該濃度進行后續(xù)試驗。

2.2 不同時間褪黑素對深層發(fā)酵靈芝菌絲體生物量、靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

在擴大培養(yǎng)不同時間添加20 μmol/L褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天收獲菌絲體，探究褪黑素不同添加時間對靈芝深層發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，第4 d加入褪黑素顯著提高靈芝菌絲體生物量(圖2A)，且提高靈芝酸含量與產(chǎn)量最明顯(P<0.05)，分別達到31.66、358.69 mg/L，為對照組的1.39、1.74倍。故下面試驗選擇第4天加入褪黑素。

圖2 褪黑素不同添加時間對靈芝菌絲生物量(A)、靈芝酸含量(B)和靈芝酸產(chǎn)量(C)的影響

2.3 不同收獲時間褪黑素對深層發(fā)酵靈芝菌絲體生物量、靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

在菌絲體擴大培養(yǎng)至第4天時加入20 μmol/L褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)至第5、7、8、9、11天收獲菌絲體。結(jié)果表明，第11天收獲菌絲體生物量最高(圖3A)，第8天收獲時靈芝酸含量(圖3B)與產(chǎn)量(圖3C)均達到最大值。

綜上所述，本試驗獲得最佳方案為：擴大培養(yǎng)至培養(yǎng)第4天加入20 μmol/L褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)第8天收獲菌絲體，靈芝酸產(chǎn)量達到最大值393.88 mg/L。

圖3 不同收獲時間對靈芝菌絲生物量(A)、靈芝酸含量(B)和靈芝酸產(chǎn)量(C)的影響

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)褪黑素在在動物和植物細胞內(nèi)抵御不良環(huán)境引起的氧化脅迫方面的研究報道較多，其主要作用方式如下：(1)作為強抗氧化劑，褪黑素可以直接清除羥基自由基等活性氧，(2)刺激SOD、CAT和GPX等抗氧化酶活性升高而增強細胞抗氧化能力;(3)提升細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽和抗壞血酸等含量;(4)提高線粒體內(nèi)膜上電子傳遞體的效率而減少活性氧的生成[12-13]。有關(guān)褪黑素在微生物中的相關(guān)研究非常少，僅有幾篇文獻報道釀酒酵母在發(fā)酵過程中細胞內(nèi)褪黑素水平與其生長曲線呈現(xiàn)正相關(guān)，可能具有促進生長代謝作用[14-15]，外源褪黑素處理可以上調(diào)釀酒酵母細胞中SOD、CAT、GPX酶活性和硫氧還蛋白基因表達水平，增強酵母在過氧化氫、UV等脅迫時的抵御能力[5-7]，其具體的生理功能未見報道。不過，經(jīng)酵母發(fā)酵的食品(如面包、啤酒、紅酒和果酒等)中褪黑素及其同分異構(gòu)體含量顯著升高，表明褪黑素及其同分異構(gòu)體與微生物有著密不可分的關(guān)系[16]。

在動物和植物細胞中，褪黑素作為誘導劑誘導次生代謝產(chǎn)物方面的研究報道較少。最近，許麗麗等的研究表明，100 μmol/L褪黑素浸泡轉(zhuǎn)色期的葡萄果實，能夠誘導上調(diào)30個葡萄芪類合酶基因sts表達，顯著提高葡萄果實中白藜蘆醇含量[17]。Gong等的研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L褪黑素澆灌處理Malus hupehensis，可以上調(diào)多胺生物合成相關(guān)的6個關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平，提高細胞中多胺含量，從而增強抗堿脅迫能力[18]。李大菲等報道，1 μmol/L褪黑素和光照聯(lián)合脅迫單針藻細胞，乙酰輔酶A羧化酶和蘋果酸酶活性上升而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性下調(diào)，有效促進了微藻細胞油脂的積累[19]。

本研究表明，10～100 μmol/L褪黑素溶液處理均能提高靈芝菌絲體生物量(圖1A)，說明褪黑素具有促進靈芝菌絲生長的作用，這與Bisquert等以酵母為材料的研究結(jié)果相一致。一般認為褪黑素可以縮短真菌生長滯后期，使其提前進入對數(shù)生長期[6]。液體發(fā)酵培養(yǎng)至第4天加入褪黑素，繼續(xù)培養(yǎng)至第8天收獲能夠顯著提高靈芝酸含量和靈芝酸產(chǎn)量，這符合靈芝生長規(guī)律和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生規(guī)律[7]。這是有關(guān)褪黑素在大型真菌靈芝菌絲上應(yīng)用的首次報道，其具體的誘導機制可能與水楊酸和生長素等類似。近來的研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸、乙烯、茉莉酸和生長素等植物激素均可誘導靈芝酸生物合成相關(guān)酶的基因表達，從而提高靈芝酸含量[9-10]；由于褪黑素的化學結(jié)構(gòu)與生長素類似，其在植物中的生理功能與生長素和水楊酸等有相同之處，褪黑素可能是通過與水楊酸或者生長素等信號轉(zhuǎn)導途徑誘導靈芝酸的生物合成[4]。

此外，靈芝酸的合作需要氧化脅迫環(huán)境，一定濃度的水楊酸、一氧化氮、過氧化氫和醋酸等物質(zhì)可誘導活性氧水平的提高，誘導靈芝酸MVA生物合成途徑中相關(guān)酶基因的表達，從而促進靈芝酸生物合成[9]。在動物細胞內(nèi)的褪黑素發(fā)揮抗癌作用時，是通過刺激脂氧合酶活性而促發(fā)活性氧產(chǎn)生[1]。Gong等研究顯示，褪黑素通過降低番茄細胞中的一氧化氮解除NADPH氧化酶的硝?；癄顟B(tài)而使酶活性升高，從而促使信號分子H2O2水平升高，刺激抗性基因表達水平上調(diào)，最終促發(fā)堿氧化脅迫耐性[20]。靈芝細胞中的褪黑素是通過刺激脂氧合酶活性還是解除NADPH氧化酶硝?；龠MH2O2等活性氧產(chǎn)生，從而導致靈芝酸生物合成能力增強，有待進一步研究。