毛軒睿 邵金華 孔 童 楊開誠

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199)

野黃桂(CinnamomumjensenianumHand.-Mazz)是樟科樟屬植物，主要分布于中國湖南西部、湖北、四川、江西和廣東等地。野黃桂葉具有行氣活血、散寒止痛之功，主治脘腹冷痛、風(fēng)寒濕痹、跌打損傷等癥狀，其主要成分為揮發(fā)油[1-3]。揮發(fā)油(Volatile oils)又稱精油，是存在于植物的花、葉、莖、根或果實中的一類具有揮發(fā)性，可以隨水蒸氣一起蒸餾出來的油狀液體的總稱，是植物重要的次生代謝物質(zhì)之一[4-5]。但是此類成分在氧、光、熱的作用下極易分解、變質(zhì)而致穩(wěn)定性較差，因此揮發(fā)油質(zhì)量保存較難，常采用微膠囊技術(shù)[6-8]。目前，對野黃桂葉揮發(fā)油的研究主要集中在揮發(fā)油的提取、成分分析及其活性研究[1-3]，而對野黃桂葉揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物制備工藝研究及其包合物評價未見報道。本研究擬以β-環(huán)糊精為材料，用單因素和正交試驗優(yōu)化野黃桂葉揮發(fā)油包合工藝，同時通過薄層色譜法(TLC)、紫外分光光度法(UV)、差示掃描量熱法(DSC)以及顯微成像法對野黃桂葉揮發(fā)油包合物進行評價，以期為野黃桂葉揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野黃桂葉：于2016年10月采自湖南隆回，將野黃桂葉40 ℃真空干燥箱烘干、粉碎，過40目篩，用塑料袋封口，4 ℃冰箱保存待用；

β-環(huán)糊精、無水乙醇、無水硫酸鈉、石油醚、乙酸乙酯：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

香蘭素：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

濃硫酸：分析純，衡陽市凱興化工試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：AUY-120型，日本津島公司；

微波超聲波組合合成萃取儀：XH-300B型，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；

臺式高速離心機：TG16G型，湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2401PC型，日本津島公司；

電子顯微鏡：PH100-2A41 L-EP型，江西鳳凰生物有限公司；

差示掃描熱量儀：DSC-60A型，日本津島公司。

1.2 方法

1.2.1 野黃桂葉揮發(fā)油的制備 取過40目篩的野黃桂葉干燥粉末100 g，料水比為1∶15 (g/mL)，25 ℃加水浸泡24 h，然后將其置于2 000 mL圓底燒瓶內(nèi)，上端連接好冷凝管和揮發(fā)油提取器，100 ℃提取5 h，收集揮發(fā)油提取器內(nèi)油狀液體，無水硫酸鈉干燥，4 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 野黃桂葉揮發(fā)油包合物的制備 將野黃桂葉揮發(fā)油與無水乙醇按1∶7的體積比混合均勻后，取一定量的混合溶液，將其逐滴加入到飽和溶液中(稱取一定量的β-環(huán)糊精溶解于蒸餾水中，使之形成過飽和溶液)。利用微波超聲波組合合成萃取儀超聲作用一定的時間，在50 ℃水浴鍋中保溫30 min，然后冷卻至室溫后，貯藏于4 ℃冰箱放置24 h，抽濾，加入適量的蒸餾水洗去吸附在包合物表面未包合的β-環(huán)糊精，最后放置于40 ℃干燥箱中干燥至恒重，即得野黃桂葉揮發(fā)油包合物[9]。

1.2.3 野黃桂葉揮發(fā)油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用移液管吸取0.2 mL 野黃桂葉揮發(fā)油滴入25 mL 容量瓶，用無水乙醇定容，上下倒置搖勻，再分別用移液管量取上述溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于5 mL容量瓶中，用無水乙醇分別定容到5 mL。無水乙醇作為對照品溶液，在225 nm 波長下測定吸光度值。以野黃桂葉揮發(fā)油的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制野黃桂葉揮發(fā)油的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 包埋率和包合物得率的測定

(1) 包合物表面揮發(fā)油的測定：根據(jù)彭穎[10]的方法改進，稱取適量的包合物，用適量的無水乙醇充分洗滌、過濾，濾液用無水乙醇定容到25 mL，然后在225 nm下測定吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計算出野黃桂葉揮發(fā)油包合物表面揮發(fā)油的含量。

(2) 包合物總揮發(fā)油的測定：稱取適量的包合物，用適量的水溶解，然后加入少量的無水硫酸鈉吸盡水分后，冷卻，再用適量的無水乙醇萃取包合物里揮發(fā)油，過濾，濾液用無水乙醇定容到25 mL，然后在225 nm下測定吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計算出野黃桂葉揮發(fā)油包合物總揮發(fā)油的含量[9]。按式(1)計算包埋率。

(1)

式中：

c——包埋率，%；

m1——包合物表面揮發(fā)油，g；

m2——包合物總揮發(fā)油，g。

1.2.5 野黃桂揮發(fā)油包合物制備單因素試驗

(1) 超聲波處理時間的確定：超聲波連續(xù)超聲時間分別設(shè)定為4，6，8，10，12 min，β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶10，芯材(野黃桂葉揮發(fā)油)與壁材(β-環(huán)糊精)質(zhì)量比為1∶7，超聲波功率為120 W，超聲溫度為40 ℃，制備包合物，測定包埋率。

(2) 超聲波溫度的確定： 超聲波溫度為別設(shè)定為30，35，40，45，50 ℃，超聲波連續(xù)超聲時間為8 min，β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶10，芯材(野黃桂葉揮發(fā)油)與壁材(β-環(huán)糊精)質(zhì)量比為1∶7，超聲波功率為120 W，制備包合物，測定包埋率。

(3) 芯材與壁材質(zhì)量比的確定：芯材與壁材分別按1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9的質(zhì)量比混合，其中β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶10，超聲波連續(xù)超聲時間為8 min，超聲波功率為120 W，超聲溫度為40 ℃，制備包合物，測定包埋率。

(4) 超聲波功率的確定：設(shè)定數(shù)控超聲波清洗器的功率分別為60，90，120，150，180 W，超聲波連續(xù)超聲時間為8 min，β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶10，芯材與壁材質(zhì)量比為1∶8，超聲溫度為40 ℃，制備包合物，測定包埋率。

(5)β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比的確定：β-環(huán)糊精與水分別按1∶3，1∶6，1∶9，1∶12，1∶15的質(zhì)量比配置溶液，芯材與壁材質(zhì)量比為1∶8，超聲波連續(xù)超聲時間為8 min，超聲波功率為150 W，超聲溫度為40 ℃，制備包合物，測定包埋率。

1.2.6 野黃桂葉揮發(fā)油包合物制備正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以包埋率為指標(biāo)，選擇超聲波處理時間、芯材與壁材質(zhì)量比、超聲波功率和β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為考察因素，利用L9(34)正交表進行試驗。

1.2.7 包合物評價

(1) 薄層色譜法(TLC)：稱取100 mgβ-環(huán)糊精，用1 mL無水乙醇超聲溶解15 min，離心，取上清液，即樣品溶液I；用精密移液槍移取包埋前野黃桂揮發(fā)油0.1 mL，用0.1 mL無水乙醇稀釋溶解，即樣品溶液II；稱取100 mg包合物，與樣品溶液I的處理方法相同，即樣品溶液III；將野黃桂揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合，加入5 mL 無水乙醇超聲溶解15 min， 3 000 r/min離心10 min，取上清液，即樣品溶液IV。最后用定量毛細(xì)管分別吸取上述4 組樣品溶液在硅膠G薄層板上點樣，置于乙酸乙酯與石油醚按1∶25的體積比配置的展開劑中，跑板，取板，晾干，用5%香草醛濃硫酸溶液噴霧顯色，放置在105 ℃干燥箱中烘干至條帶清晰[11-13]。

(2) 紫外分光光度法(UV)：樣品溶液按1.2.7(1)制備，并在200～300 nm內(nèi)用紫外掃描。

(3) 差示掃描量熱法(DSC)：對β-環(huán)糊精、野黃桂揮發(fā)油和β-環(huán)糊精物理混合物、包合物3種樣品進行了差示熱分析，測定條件：以空氧化鋁(Al2O3)坩堝為參比，另一Al2O3坩堝放入樣品，升溫速度為10 ℃/min，氮氣流動速度為20 mL/min，掃描范圍0～400 ℃，分別記錄樣品的DSC 升溫曲線[14-15]。

(4) 顯微成像法：稱取未研磨的β-環(huán)糊精、研磨的β-環(huán)糊精、野黃桂揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物各一定量制成溶液，分別滴于載玻片上，用顯微鏡觀察其成像并捕捉照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可知，野黃桂葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度和吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.099 7x+0.029 3，R2= 0.993 8，野黃桂葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度在0.16～1.60 mg/mL 時與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 野黃桂葉揮發(fā)油標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of absorbency of volatile oil from >Cinnamomum jensenianum

2.2 超聲波法制備野黃桂葉揮發(fā)油包合物工藝優(yōu)化

2.2.1 超聲波處理時間對包埋率的影響 由圖2可以看出，包埋率隨著超聲波處理時間的延長，呈先上升再下降的趨勢。當(dāng)超聲波處理時間為8 min時，野黃桂葉揮發(fā)油包埋率最高，為(15.80±0.19)%?？赡苁请S著超聲作用時間的延長、溫度上升，揮發(fā)油不斷地被包合，使得包埋率上升，當(dāng)超聲的時間為8 min時，包埋率最大，繼續(xù)延長超聲時間，處理液會繼續(xù)變熱，過高的溫度會使揮發(fā)油揮發(fā)，此后揮發(fā)油包埋率開始有下降的趨勢。因此，從揮發(fā)油包埋效率和節(jié)約能源兩方面綜合考慮，選擇最佳超聲波包埋時間為8 min。

2.2.2 超聲波溫度對包埋率的影響 由圖3可以看出，包埋率隨著超聲溫度的提高，呈先上升再下降的趨勢，但差異不顯著。當(dāng)超聲溫度為40 ℃時，野黃桂葉揮發(fā)油包埋率最高，為(18.39±0.26)%。可能是隨著超聲溫度升高，揮發(fā)油不斷地被包合，使得包埋率上升，當(dāng)超聲溫度為40 ℃時，包埋率最大，提高超聲溫度，揮發(fā)油稍有揮發(fā)，當(dāng)溫度超過50 ℃，揮發(fā)油揮發(fā)的速度加快。因此，最佳超聲溫度為40 ℃。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖2 超聲波處理時間對包埋率的影響Figure 2 Influence of different ultrasonic treatment time on the embedding rate

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖3 超聲波溫度對包埋率的影響Figure 3 Influence of different ultrasonic treatment temperature on the embedding rate

2.2.3 芯材與壁材質(zhì)量比對包埋率的影響 由圖 4 可看出，包埋率隨著芯壁比的減小先上升再下降。在芯壁比為1∶7時，野黃桂揮發(fā)油β-環(huán)糊精包埋率最高，達到了(18.04±0.22)%。在一定壁材使用范圍內(nèi)，壁材含量增加有利于其包裹能力增強，在芯壁比為1∶7 時，β-環(huán)糊精溶液能很好地包埋野黃桂揮發(fā)油，形成了穩(wěn)定的包埋體系，繼續(xù)增加壁材的使用量，包埋率下降。因此，最佳的芯材與壁材質(zhì)量比為1∶7。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖4 芯材與壁材質(zhì)量比對包埋率的影響Figure 4 Influence of different core wall ratio on embedding rate

2.2.4 超聲波功率對包埋率的影響 由圖 5 可以看出，包埋率隨著超聲波功率的增加，呈平穩(wěn)上升的趨勢，在超聲波功率為120 W時，野黃桂揮發(fā)油包埋率最高，包埋效果最好，達到了(14.72±0.11)%，繼續(xù)增加超聲波功率，包埋率反而下降。包埋率變化的原因可能是在一定的時間內(nèi)，超聲波功率越大，物質(zhì)分散越均勻，而溶液則越熱，由于β-環(huán)糊精制備野黃桂揮發(fā)油包合物是分子包合過程，溫度過高，會促使β-環(huán)糊精分解，同時包埋的揮發(fā)油也可能會揮發(fā)，所以包埋率有所下降。因此，最佳的超聲功率為120 W。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖5 超聲波功率對包埋率的影響Figure 5 Influence of different ultrasonic power on embedding rate

2.2.5β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比對包埋率的影響 由圖6可以看出，包埋率隨水的增加呈先上升再下降的趨勢。當(dāng)β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶9時，野黃桂揮發(fā)油包埋效果最佳，包埋率最高為(15.68±0.07)%?？赡苁菬o極性的外來分子迅速被β-環(huán)糊精分子的非極性基團占據(jù)的水分子置換，由此，水量適量增加利于包埋進行，形成的包埋物比較穩(wěn)定；當(dāng)水分過多時，β-環(huán)糊精的非極性部位與水分子結(jié)合，阻礙揮發(fā)油進入環(huán)形部位，降低了野黃桂揮發(fā)油的包埋率[16]。因此，β-環(huán)糊精與水最佳的質(zhì)量比為1∶9。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖6 β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比對包埋率的影響Figure 6 Influence of different β-cyclodextrin and water quality ratio on embedding rate

2.2.6 超聲波法制備野黃桂葉揮發(fā)油包合物正交試驗 由于超聲溫度影響不顯著，本試驗以超聲波處理時間、芯材(野黃桂葉揮發(fā)油)與壁材(β-環(huán)糊精)質(zhì)量比、超聲波功率、β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比進行四因素三水平正交試驗。正交試驗因素水平表見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2可知，各因素對包埋率影響的主次順序依次為B>A>D>C，包合物的最佳制備工藝條件為A2B3C3D2，即超聲波處理時間為8 min，芯材(野黃桂揮發(fā)油)與壁材(β-環(huán)糊精)質(zhì)量比為1∶8，超聲波功率為150 W，β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶9。由表3 可知，在試驗范圍內(nèi)，因素B對包埋率有顯著性影響；因素A、C和D對包埋率都有不同程度的影響，但不顯著。

2.2.7 工藝驗證實驗 按照優(yōu)選出的最佳工藝A2B3C3D2，即超聲波處理時間8 min，芯材與壁材質(zhì)量比1∶8，超聲波功率150 W，β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比1∶9，超聲溫度40 ℃，利用超聲波法對野黃桂葉揮發(fā)油進行3次重復(fù)性包埋實驗，包合物的平均包埋率為(20.45±0.03)%，均高于正交試驗，由此判斷正交試驗得出的制備工藝條件為最佳制備工藝條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level table of orthogonal test factors

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析表?Table 3 Anova table

2.3 包合物結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.3.1 薄層色譜 由圖7可看出，樣品II和IV溶液在相同的位置上出現(xiàn)了一個相同顏色的斑點，且Rf 值基本相同，野黃桂葉揮發(fā)油有一個主要的化學(xué)成分是芳樟醇(相對含量達到94.449%)，與薄層色譜結(jié)果相一致；樣品I和III溶液中沒有斑點出現(xiàn)，表明野黃桂葉揮發(fā)油包合物已經(jīng)形成，其表面并無揮發(fā)油殘留，而且包合前后野黃桂葉揮發(fā)油主要的化學(xué)成分未見明顯的變化，所以包合物質(zhì)量較好，說明包埋過程對揮發(fā)油成分無影響。

I. β-環(huán)糊精 II. 包合前所提野黃桂葉揮發(fā)油 III. 包合物 IV. 野黃桂葉揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物

2.3.2 紫外分光光度 由圖8可看出，樣品I和III溶液無野黃桂葉揮發(fā)油的特征吸收峰，而樣品II和 IV溶液在相同位置上有野黃桂葉揮發(fā)油類似的吸收峰，說明野黃桂葉揮發(fā)油己經(jīng)被β-環(huán)糊精包埋在疏水性空腔結(jié)構(gòu)中，且已經(jīng)構(gòu)成一種新的物質(zhì)。

I. β-環(huán)糊精 II. 包合前所提野黃桂葉揮發(fā)油 III. 包合物 IV. 野黃桂葉揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物

2.3.3 差示掃描量熱 由圖9可看出，樣品A中β-環(huán)糊精在225.27 ℃ 有吸熱峰；樣品B中野黃桂葉揮發(fā)油與β-環(huán)糊精進行了簡單的物理包合，還是顯示出了β-環(huán)糊精的特征波峰，這是因為野黃桂葉揮發(fā)油中有較多的低沸點揮發(fā)性成分存在，致使β-環(huán)糊精的特征波峰由225.27 ℃ 降低至212.61 ℃；而樣品 C即包合物中沒有β-環(huán)糊精特征波峰存在，而是出現(xiàn)了新的特征波峰，開始與結(jié)束之間的溫差跨度大，熱熵值明顯減小，可見二者圖譜有顯著的差別，以此推測野黃桂葉揮發(fā)油與β-環(huán)糊精之間并不是簡單吸附作用，而是發(fā)生了分子間作用[17-18]，表明揮發(fā)油包合物己經(jīng)形成了一種新的物質(zhì)。

2.3.4 顯微成像β-環(huán)糊精(A)、研磨后β-環(huán)糊精(B)及包合物(C)的顯微成像圖如圖10所示。由圖10可看出，未研磨β-環(huán)糊精和研磨后β-環(huán)糊精為無色半透明立方體狀結(jié)晶顆粒，顆粒粒度相對較大且清晰可辨，而野黃桂葉揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物為黑色不透明不規(guī)則團狀物質(zhì)。試驗表明β-環(huán)糊精僅在外力作用下并未發(fā)生變化，而β-環(huán)糊精包合野黃桂葉揮發(fā)油后，其形態(tài)顏色均發(fā)生改變，顯示新物質(zhì)已經(jīng)形成。

A. β-環(huán)糊精 B. 野黃桂葉揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物 C. 包合物

圖10 不同樣品的顯微成像圖Figure 10 β-cyclodextrin, The β-cyclodextrin after grinded, Clathrate

3 結(jié)論

(1) 野黃桂葉揮發(fā)油包合物最佳制備工藝條件為：超聲波處理時間為8 min，芯材(野黃桂揮發(fā)油)與壁材(β-環(huán)糊精)質(zhì)量比為1∶8，超聲波功率為150 W，β-環(huán)糊精與水質(zhì)量比為1∶9，超聲溫度為40 ℃時，包合物的包埋率和包埋得率指標(biāo)達到最佳，分別為(20.45±0.03)%和(87.63±0.15)%。該工藝制備的野黃桂揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的包埋率和包埋得率高，方法簡單、可靠、穩(wěn)定性強。

(2) 野黃桂葉揮發(fā)油與β-環(huán)糊精已經(jīng)形成包合物，野黃桂葉揮發(fā)油在包合前后化學(xué)成分沒有發(fā)生明顯變化，包合物性質(zhì)較為穩(wěn)定，顆粒大小形狀均勻，粉末形態(tài)好。包合物的形成可提高野黃桂揮發(fā)油的持效性和緩釋性，為野黃桂揮發(fā)油在日化、食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

(3) 野黃桂葉揮發(fā)油在包合的過程中還有部分未被包埋或者吸附在包合物的表面，在包埋過程中造成損失。因此，如何進一步提高揮發(fā)油的包埋率和包埋得率，還需深入探討。