欒 劍 曹歡歡 周曉馥

(1. 吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平 136000；2. 朝陽市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，遼寧 朝陽 122000)

1 姜黃素與CFTR

1.1 姜黃素簡介

姜黃素[1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione]是從植物姜黃(CurcumalongaL.)的根中提取的。姜黃原產(chǎn)于東南亞，于13世紀(jì)被阿拉伯商人引入歐洲，其根部常被用作食物和調(diào)味品。馬可波羅在1208年訪問中國和印度的游記中提到過姜黃，而姜黃在中國傳統(tǒng)中藥以及印度的阿育吠陀和阿拉伯藥物中被用來減輕各種疾病癥狀已有千年歷史[1]。《中國藥典》2010版指出，姜黃辛、苦、溫。入脾、肝經(jīng)。破血、行氣、通經(jīng)、止痛。臨床常用來治療血瘀氣滯諸痛證、風(fēng)濕痹痛證、癰疽疔毒證。

自1815年被提取出來[2]，對姜黃素的研究就一直備受矚目。人體對姜黃素的耐受性很高，最高可達(dá)12 g/d，有時伴有輕微腹瀉等副作用。姜黃素的口服生物利用度較低[3]，主要表現(xiàn)為一次代謝、胃腸道吸收低、水溶性差、排泄快等[4]。姜黃素具有抑制腫瘤發(fā)生[5-6]、抗炎癥[7-8]、抗抑郁[9]、預(yù)防糖尿病[10]、預(yù)防心血管疾病[11-12]和增強(qiáng)神經(jīng)活性[13]等多重藥理作用，有學(xué)者稱贊其為“The yellow magic”[14]。姜黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

1.2 CFTR及其突變體

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種定位于分泌

圖1 姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of curcumin

性上皮細(xì)胞頂膜的氯離子通道。遺傳性致死疾病囊性纖維化，正是由于CFTR基因的突變造成，△F508和 G551D都是常見的突變類型。占突變總數(shù)85%以上的△F508是CFTR基因的第508位上苯丙氨酸的缺失造成ER合成的CFTR蛋白錯誤折疊，并滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，隨即被降解，使得整個機(jī)體所有的CFTR氯離子通道功能嚴(yán)重不足，導(dǎo)致呼吸衰竭、腸道梗阻、不孕不育等一系列癥狀，病人平均壽命只有30余年。因此，激活CFTR氯離子通道活性的小分子調(diào)節(jié)劑，成為治療囊性纖維化疾病的藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

2 姜黃素對CFTR氯離子通道的激活作用的論證與反駁

2.1 發(fā)現(xiàn)

2004年4月耶魯醫(yī)學(xué)院的Egan在《Science》上發(fā)表了原創(chuàng)試驗(yàn)文章[15]，指出給攜帶純合△F508-CFTR基因的小鼠喂服姜黃素，使得鼻電位差基線由(-27.9±0.77) mV 降到(-10.8±0.62) mV，該數(shù)據(jù)幾乎與野生型[(-8.36±0.55) mV]等同，而這些效應(yīng)在敲除了CFTR基因的小鼠中則沒有觀察到。用姜黃素治療后，△F508-CFTR突變小鼠對FSK有(4.46±1.0) mV的超極化反應(yīng)，該數(shù)值約為野生型和雜合型小鼠的91%。在37 ℃下用不同濃度的姜黃素處理細(xì)胞使得△F508-CFTR蛋白的一部分通過生物合成途徑并獲得較原來更為復(fù)雜的糖基化，以完成蛋白質(zhì)組裝行使功能，且能夠誘導(dǎo)△F508-CFTR蛋白向細(xì)胞質(zhì)膜定位。并指出，姜黃素從ER中釋放△F508-CFTR的能力與鈣網(wǎng)蛋白和△F508-CFTR相互作用的分解有關(guān)。此外，姜黃素表現(xiàn)出與異黃酮化合物的結(jié)構(gòu)相似性，異黃酮化合物可以直接結(jié)合到CFTR蛋白并改變其通道性質(zhì)[16]。因此，姜黃素也可能直接與CFTR結(jié)合，從而允許其避開ER的監(jiān)控機(jī)制。

文章[17]總結(jié)姜黃素治療可以糾正與純合△F508-CFTR相關(guān)的癥狀(如圖2)。此外，Egan在文[15]中強(qiáng)調(diào)其試驗(yàn)使用的口服姜黃素的劑量可與人類良好耐受的劑量相媲美(基于體重?fù)Q算)，該試驗(yàn)數(shù)據(jù)小鼠口服給藥劑量為45 mg/kg，為期3 d。

2.2 反駁

Egan等[15]的文章引來學(xué)界的強(qiáng)烈反響，僅在2004～2005年就有多篇對姜黃素激活CFTR氯離子通道持懷疑態(tài)度的針對性科研論文發(fā)表。

2004年7月，加州大學(xué)圣地亞哥分校的Verkman教授[18]在老牌雜志JBC發(fā)表了一篇論文，指出無法支持Egan的論斷。Verkman教授是離子通道界的杰出科學(xué)家，其在水通道、CFTR氯離子通道等領(lǐng)域的研究始終處于世界領(lǐng)先水平。文章開篇直指Egan使用姜黃素進(jìn)行研究的理由是姜黃素在0.5×10-5～1.5×10-5μmol/L濃度下作為SERCA的弱抑制劑的作用[18]，這是基于先前研究報告，即同為SERCA抑制劑的Thapsigargin被報道恢復(fù)了△F508-CFTR功能[19]。然而，臨床研究[20-21]表明，口服姜黃素的生物利用度非常低，肝臟代謝迅速，高劑量給藥后血液中僅檢測到低納米摩爾水平，拋出了他對Egan研究結(jié)果的疑慮。

圖2 姜黃素、鈣離子和囊性纖維化[17]Figure 2 Curcumin, Calcium, and Cystic Fibrosis

隨后，以重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的角度出發(fā)，再次對姜黃素激活△F508-CFTR的論斷提出質(zhì)疑。首先，在表達(dá)△F508-CFTR的FRT細(xì)胞中，添加了1.0～4.0×10-6μmol/L的姜黃素在37 ℃預(yù)培養(yǎng)24 h的細(xì)胞中檢驗(yàn)碘離子流入，結(jié)果為陰性。其次，以 27 ℃處理組為對照，姜黃素也不能增加初代培養(yǎng)的純合△F508-CFTR人類呼吸道上皮細(xì)胞的短路電流。再次，在純合△F508-CFTR的突變小鼠中，姜黃素僅能誘導(dǎo)(2.1±0.4) mV超極化。最后，液相色譜/質(zhì)譜分析表明最大濃度6.0×10-8μmol/L，血清濃度遠(yuǎn)低于0.5×10-5～1.5×10-5μmol/L。綜上所述，無法證明姜黃素在轉(zhuǎn)染細(xì)胞、上皮氣道細(xì)胞和突變小鼠中糾正△F508-CFTR功能性缺陷方面具有顯著的作用。此外，所測量的姜黃素的口服生物利用度表明，其最大血清濃度比產(chǎn)生SERCA抑制的建議值低好幾個數(shù)量級。因此，Verkman課題組的試驗(yàn)結(jié)果不支持姜黃素治療由△F508-CFTR突變引起的囊性纖維化的評估。

隨后，同年7月Dragomir等[22]指出，姜黃素在試驗(yàn)中對CFBE和CF鼻上皮細(xì)胞的(非CFTR介導(dǎo)的)基底膜氯離子外排有一定的影響，但并沒有增加(真正的CFTR氯離子通道介導(dǎo)的)環(huán)腺苷酸活化的氯離子外排，而△F508-CFTR 在BHK細(xì)胞中出現(xiàn)少量增加。值得指出的是，野生型BHK細(xì)胞缺乏CFTR，但是很容易被轉(zhuǎn)染，成為含有非常高水平的野生型或突變型CFTR蛋白的細(xì)胞。雖然轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞是研究CFTR功能的模型，但它是高度人工的體系，不能代表真實(shí)的氣道上皮細(xì)胞。試驗(yàn)使用的新分離的鼻上皮細(xì)胞則盡可能地接近體內(nèi)情況，而無需進(jìn)行實(shí)際的臨床試驗(yàn)。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果未能觀察到△F508-CFTR向細(xì)胞質(zhì)膜顯著的轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，姜黃素不太可能在氣道上皮細(xì)胞也就是囊性纖維化患者需要治療的靶細(xì)胞中對CFTR介導(dǎo)的氯離子跨膜運(yùn)輸產(chǎn)生顯著的正向作用。

同年9月，一篇名為《Some like it hot: curcumin and CFTR》的短評[23]刊出，當(dāng)然，這個標(biāo)題也是瑪麗蓮夢露最賣座的電影名稱，來自凱斯西儲大學(xué)醫(yī)學(xué)院的兩位科學(xué)家在“hot”這個詞上一語雙關(guān)，對應(yīng)了“姜黃”之“辣”，也寄希望于姜黃素能夠延續(xù)之前的“熱”度，給囊性纖維化病人帶來真正的福音。即便是抱有如此樂觀期待的科研短評，作者依然在文末指出：小鼠與人類△F508-CFTR之間可能存在的差異，必須考慮是否可以將來自小鼠的數(shù)據(jù)擴(kuò)展到人類。有研究[24]表明，小鼠△F508-CFTR蛋白質(zhì)可能比人類同源物到達(dá)細(xì)胞表面的效果要更好。而且，如果姜黃素在體內(nèi)具有可重現(xiàn)性，則必須確定其持續(xù)時間。如果確定姜黃素是一種可行的治療方法，就必須獲得姜黃素的安全性數(shù)據(jù)。雖然在許多人的飲食中發(fā)現(xiàn)了這些化合物，但建議的治療方法是長期使用高劑量，這一點(diǎn)尚未得到安全評估。此外，如果姜黃素能夠繼續(xù)被證明具有激活△F508-CFTR的活性，那么必須要了解它的藥物動力學(xué)和藥效動力學(xué)，并在囊性纖維化患者中驗(yàn)證其安全性和效果。雖然其他實(shí)驗(yàn)室無法證實(shí)Egan等最初的試驗(yàn)結(jié)果，但激活△F508-CFTR的可能性是具有如此重要的治療意義，因此對姜黃素治療囊性纖維化的潛力進(jìn)行徹底的研究是有必要的。

時隔不久，又一篇駁斥姜黃素激活突變型CFTR的原創(chuàng)試驗(yàn)性論文[25]在2004年10月刊出，文章題目直指無論是之前的Thapsigargin還是現(xiàn)在的姜黃素，都無法促進(jìn)錯誤折疊的CFTR蛋白成熟。這與Verkman實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)表[18]的結(jié)論相印證。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，將穩(wěn)定表達(dá)△F508-CFTR突變型的BHK細(xì)胞，用不同濃度的Thapsigargin(0.0～1.0×10-5μmol/L)或姜黃素(0.0～3.0×10-5μmol/L)處理細(xì)胞18 h。結(jié)果顯示細(xì)胞在27 ℃下培養(yǎng)可顯著提高成熟CFTR的產(chǎn)量，這與其他[26]報道的結(jié)果相符。然而，當(dāng)在Thapsigargin或姜黃素存在下培養(yǎng)細(xì)胞時，全細(xì)胞提取物的免疫印跡分析顯示未檢測到成熟CFTR的增加。因此，在ER中對△F508-CFTR-伴侶蛋白相互作用體系的簡單破壞不太可能糾正錯誤折疊的CFTR突變蛋白質(zhì)。事實(shí)上，先前已有研究[27]表明△F508-CFTR-伴侶蛋白相互作用的中斷加速了蛋白酶體的降解。另外，此文也指出，在姜黃素達(dá)到最高濃度(3.0×10-5μmol/L)時，P-gp的產(chǎn)量減少，這印證了姜黃素在高濃度下引起細(xì)胞凋亡的事實(shí)。

這些負(fù)面報道，以及在2004年的傳統(tǒng)囊性纖維化威廉斯堡(USA)會議上反對使用姜黃素的批評聲音，都警告人們不要給患有囊性纖維化孩子的家庭虛無的希望。2005年1月，一篇科學(xué)評論文章[28]指出：關(guān)于姜黃素激活突變體CFTR的研究，由于后續(xù)的研究未能重現(xiàn)這些最初曾經(jīng)令人興奮的結(jié)果，導(dǎo)致人們對它的懷疑與日俱增。比如動物的遺傳背景不同，或者姜黃素的來源不同，甚至給藥和處理動物也可能有影響。推測姜黃素在體內(nèi)的作用很可能與化合物中一種尚未識別的活性代謝物有關(guān)，而不是姜黃素本身。姜黃素治療小鼠的死亡率降低也可能是姜黃素在治療小鼠腸內(nèi)的局部通便作用造成的。因此，盡管草本來源的膳食補(bǔ)充劑是理想的合成藥物的替代品，但它們的功效需要在體內(nèi)和體外進(jìn)行仔細(xì)的評估。

2005年11月，又一篇原創(chuàng)試驗(yàn)性論文[29]報道，SERCA抑制劑姜黃素和Thapsigargin無法糾正△F508-CFTR小鼠中觀察到的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷。檢測從這些培養(yǎng)物中得到的高度敏感的免疫印跡或免疫沉淀物，在有和沒有姜黃素的情況下都檢測到明顯的未成熟△F508-CFTR蛋白帶。同時，Song等[18]的研究給小鼠注射15 mg/kg姜黃素后2 h 測血清，沒有在血清中檢測到姜黃素。然而，在100 mg/kg的劑量下，在給藥后2 h，檢測到3.6×10-8μmol/L的姜黃素，表明姜黃素的生物利用度非常低。而要強(qiáng)調(diào)的是，該團(tuán)隊(duì)在CF小鼠中的研究[29]超過了最初在Egan研究中描述的劑量和持續(xù)時間，并且擴(kuò)大了研究規(guī)模，包括姜黃素的其他來源、延長的劑量持續(xù)時間等。然而，那些從耶魯大學(xué)獲得的△F508-CFTR缺陷型小鼠的鼻部電位差也未被姜黃素治療和糾正。鑒于以上的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)中未能檢測姜黃素在糾正與△F508-CFTR相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷方面的任何數(shù)據(jù)，認(rèn)為在CF人類臨床試驗(yàn)中檢測姜黃素的作用為時過早。

2.3 論證

在一片反對的聲浪中，支持者也開始提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)來聲援Egan[30-31]。有報道[32-33]稱，姜黃素通過減少通道閉合時間和延長通道保持開放時間來增加細(xì)胞膜片中的CFTR通道活性。這種激活是劑量依賴性的、可逆的，并且比用GST觀察到的要大，GST是另一種刺激CFTR的化合物。姜黃素依賴的刺激需要磷酸化通道和ATP的存在。姜黃素只激活磷酸化的CFTR，其作用于高磷酸化通道時增強(qiáng)。此外，姜黃素濃度對CFTR的PKA磷酸化有部分抑制作用。這些結(jié)果表明，主要機(jī)制可能不直接涉及R區(qū)[32]。該團(tuán)隊(duì)聲稱[32]發(fā)現(xiàn)姜黃素提高了野生型和△F508通道的活性，加入姜黃素也能增加分化的非CF氣道上皮的氯轉(zhuǎn)運(yùn)，但不能增加CF上皮的氯轉(zhuǎn)運(yùn)。這些結(jié)果提示姜黃素可能直接刺激CFTR氯離子通道。

據(jù)Wang等[34]報道，ATP與NBD1結(jié)合強(qiáng)烈抑制了姜黃素對NBD2缺失突變體的刺激作用，說明NBD1是一個可能的激活位點(diǎn)。姜黃素的激活在長時間暴露于這種混合物中時變得不可逆轉(zhuǎn)，隨后在沒有任何激動劑的情況下，持續(xù)激活的通道會動態(tài)開啟。有報道[35]稱在突變型(G551D)CFTR中，姜黃素在全細(xì)胞電流中誘導(dǎo)了電壓依賴性的增強(qiáng)，推測GST增強(qiáng)和姜黃素增強(qiáng)的G551D-CFTR可能具有不同的蛋白質(zhì)構(gòu)象。姜黃素增加G551D-CFTR全細(xì)胞及單通道電流小于GST在其最大有效濃度時的作用。此外，GST和姜黃素在較低濃度范圍內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用可以協(xié)同修復(fù)G551D-CFTR的缺陷[36]。GST和姜黃素均顯著增加cAMP-PKA刺激激活的G551D-CFTR全細(xì)胞電流，但二者增效作用的時間歷程不同，即GST在啟動和關(guān)閉過程中均比姜黃素作用快，姜黃素幾乎是可逆地增強(qiáng)了G551D-CFTR(與之前報道的不可逆激活相比)[37]。姜黃素的增效作用小于GST，最高可溶濃度為6.0×10-5μmol/L。重要的是，姜黃素和GST對G551D-CFTR通道具有增強(qiáng)作用表明，二者通過不同的機(jī)制影響G551D-CFTR。

有研究[38]發(fā)現(xiàn)姜黃素處理中國倉鼠卵巢細(xì)胞抑制CRT表達(dá)，增加野生型CFTR，但不影響△F508-CFTR的表達(dá)。然而，雖然姜黃素沒有增加△F508-CFTR的表達(dá)，但它增強(qiáng)了26 ℃孵育誘導(dǎo)的△F508-CFTR的功能，這與試驗(yàn)對照組的低溫下siRNA敲除CRT的效果相似。因此，可以推論姜黃素對CFTR表達(dá)的積極作用是通過下調(diào)CFTR的負(fù)調(diào)控因子CRT介導(dǎo)的。

3 結(jié)論與展望

姜黃素的生物利用率和安全劑量始終是藥物研發(fā)時最關(guān)心的問題之一。以2 g /kg體重質(zhì)量的比率給小鼠口服姜黃素表現(xiàn)出最大的血清濃度為(1.35×10-3±0.23×10-3) g/L，(0.83±0.05) h，而人類使用相同劑量的姜黃素之后，最大血清濃度為(6×10-6±5×10-6) g/L，1 h[39]。同樣，Yang 等[40]將姜黃素以500 mg/kg體重質(zhì)量的比率給大鼠喂藥，檢查自由運(yùn)動的大鼠血漿時，顯示姜黃素僅有1%的生物利用度。此外，人口服48 g姜黃素后的血漿峰值為(0.41～1.75) mol/L，且在12 h時未觀察到血藥濃度峰值[4]。Sharma等[41]的前期研究結(jié)果顯示，在人體臨床試驗(yàn)中，口服3.6 g姜黃素1 h后，血漿中姜黃素水平降低至11.1 nmol/L，同時在血漿中和低濃度的尿液中進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在口服劑量為4 g以下時，血清中無法檢測到姜黃素。

姜黃素能夠激活野生型(WT)、△F508-CFTR[32]和G551D-CFTR[37]氯離子通道。Kirk等[34]報道姜黃素對CFTR有兩大作用：增加CFTR的ATP獨(dú)立激活和促進(jìn)CFTR分子的低聚體形成。姜黃素即使在ATP缺失的情況下也能激活G551D-CFTR突變體和WT-CFTR。值得注意的是，姜黃素活化仍然依賴于蛋白激酶A對R區(qū)的預(yù)先磷酸化，這與R區(qū)在控制CFTR功能中發(fā)揮許可作用的觀點(diǎn)一致。姜黃素誘導(dǎo)的G551D-CFTR和NBD2缺失結(jié)構(gòu)的活化，是由于開放率的增加。此外，長時間接觸姜黃素可誘導(dǎo)不可逆活化，活性強(qiáng)，短時間接觸可誘導(dǎo)可逆活化，提示姜黃素可誘導(dǎo)CFTR分子發(fā)生不可逆構(gòu)象改變。姜黃素誘導(dǎo)的CFTR寡聚體大多呈二聚體形式，這與純化后的CFTR蛋白經(jīng)天然PAGE電泳可呈二聚體形式[42-43]的結(jié)果一致。另外，姜黃素可能介導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白與CTFR之間的相互作用受到抑制，從而減少鈣結(jié)合蛋白介導(dǎo)的CFTR在ER中的滯留和降解[44]。然而，其他研究沒有發(fā)現(xiàn)△F508-CFTR在體外轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的證據(jù)或是能夠令△F508-CFTR的門控開放增加。Song等[18]的活體試驗(yàn)不能證明口服姜黃素的小鼠鼻電位差增加。然而，Wang等[45]的體外試驗(yàn)證明姜黃素也是Fe3+的重要螯合劑，而Fe3+是一種能夠抑制通道二聚化和開放的分子，無需R結(jié)構(gòu)域磷酸化和ATP-二聚化為前提。

Egan等[15]認(rèn)為姜黃素既能糾正△F508-CFTR胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙又能激活其通道開放，可是卻遭到美國、瑞士等不同國家好幾個獨(dú)立的科研團(tuán)隊(duì)的質(zhì)疑。因?yàn)椴煌芯啃〗M所用的細(xì)胞類型不同可能對結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。有些小組[46]的試驗(yàn)材料需要16 h以上才能夠糾正△F508-CFTR細(xì)胞膜定位障礙，而Lipecha等[47]使用的CFPAC-1細(xì)胞△F508-CFTR定位到細(xì)胞膜上的時間僅僅為2 h。而在水/血清溶液中，姜黃素在很短時間內(nèi)(t1/2<10 min)就會轉(zhuǎn)變?yōu)槠浣到猱a(chǎn)物，這對試驗(yàn)結(jié)果的檢測也構(gòu)成非常大的誤差。

姜黃素是從姜黃(姜黃)的根莖中分離出來的一種天然多酚化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗癌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗微生物和傷口愈合作用。關(guān)于姜黃素能否激活突變型CFTR氯離子通道的討論自2004年一直持續(xù)至今，不斷為這一學(xué)說添磚加瓦，豐富其內(nèi)涵。姜黃素對野生型、△F508突變型和G551D突變型CFTR均具有激活作用，但是姜黃素不能糾正△F508-CFTR的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。本文旨在綜述姜黃素對突變體CFTR氯離子通道的作用機(jī)制，幫助更好地理解和整合姜黃素的藥理活性的分子機(jī)制，為囊性纖維化的治療提供有力的理論基礎(chǔ)。