劉 欣 李 晶 魏玉玲 宋春滿 陳建華 繆恩銘 耿永勤 向 明 田麗梅

(云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231)

隨著煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng)第2個五年計(jì)劃的開展，在未來5年，將以精準(zhǔn)育種為核心，以突破品質(zhì)為關(guān)鍵，著力實(shí)現(xiàn)從傳統(tǒng)育種手段向以工廠化育種、模塊化育種為主體的精準(zhǔn)育種的跨越。其中基因編輯素材的篩選評價(jià)則是“優(yōu)質(zhì)低害”煙草品種培育的重要技術(shù)手段。糖類物質(zhì)是決定煙葉品質(zhì)好壞的關(guān)鍵化學(xué)成分，對煙葉品質(zhì)有著重要影響[1-2]，一直以來都是煙草化學(xué)檢測的重要項(xiàng)目[3-4]，也是國內(nèi)外煙草行業(yè)的質(zhì)量控制內(nèi)容[5-6]。

糖的測定方法主要有比色法[7-9]、流動分析法[10-12]、光度法[13-14]、氣相色譜法(GC)[15-16]、毛細(xì)管電泳法(CE)[17-18]和高效液相色譜法(HPLC)[19-22]等。由于比色法、流動分析法和光度法只能測定糖的總量；GC法需要衍生化前處理，操作步驟復(fù)雜；液相色譜法由于前處理簡單，分離效率好，檢測靈敏度高，成為煙草糖類物質(zhì)分析的重要分析手段，如煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[23]。但是該方法色譜分析時(shí)間較長(>30 min)，前處理步驟較多，無法較好地滿足大量樣品的快速分析篩選評價(jià)需求，因此亟待開發(fā)快速分析方法及與之相匹配的前處理方法。

針對以上測定需求，本研究擬開展樣品前處理批量化改進(jìn)處理研究，設(shè)計(jì)新型樣品萃取瓶，同時(shí)采用超高效液相色譜進(jìn)行分離檢測，旨在為新鮮煙葉中4種糖類物質(zhì)(果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)提供準(zhǔn)確可靠、操作簡單的快速篩選評估技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

超高效液相色譜系統(tǒng)：ACQUITY UPLC型，配置ACQUITY蒸發(fā)光散射檢測器ELSD，美國Waters公司；

超純水處理系統(tǒng)：Milli-Q50型，美國Millipore公司；

電子分析天平：AE240型，精確0.000 1 g，美國Mettler公司；

超聲波振蕩器：SK5200型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；

D-果糖、D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖：純度>99%，美國Supelco公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

三乙胺：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

5個基因編輯煙草樣品：基因編輯育種工廠；

3個正常煙草樣品：云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 糖類物質(zhì)(果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取0.5 g的果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖于100 mL的容量瓶中，用80%的甲醇水溶液溶解并定容到刻度，配制成濃度為5.0 mg/mL的4種糖物質(zhì)的儲備液，于4 ℃下避光保存；使用時(shí)分別移取合適體積的儲備液，用80%甲醇稀釋成一系列所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 色譜分析條件 分析柱為ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為75%的乙腈(內(nèi)含0.2% 三乙胺)，流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；ELSD的漂移管溫度65 ℃，載氣為氮?dú)?，載氣壓力241.32 kPa。

1.2.3 前處理方法

(1) 萃取瓶裝置：新型萃取瓶裝置主要解決適應(yīng)于高通量分析的前處理技術(shù)，結(jié)構(gòu)包含外套管(含密封圈)和內(nèi)套管(帶0.45 μm過濾篩板)。進(jìn)行樣品前處理時(shí)，樣品直接加入外套管中，加入萃取溶劑后利用密封圈將內(nèi)套管固定在管口；進(jìn)行樣品超聲處理后，直接壓入內(nèi)套管，溶液通過篩板過濾和內(nèi)套管相連接的彎管流出，使樣品過濾和轉(zhuǎn)移為一步，相較于平常前處理工作(利用注射器取樣，放置過濾頭，將濾液吸入注射器，過濾頭過濾，轉(zhuǎn)移溶液至色譜瓶的多步驟操作)具有較強(qiáng)的優(yōu)勢，可以大大提高前處理效率；另外可以避免操作人員的人為誤差，達(dá)到前處理的平行性和穩(wěn)定性。萃取瓶設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)了一種集樣品提取、過濾凈化和轉(zhuǎn)移裝瓶為一體，可以簡化操作步驟，保持樣品處理一致性的新型樣品萃取瓶，結(jié)構(gòu)見圖1。

1. 樣品萃取外管 2. 樣品 3. 密封圈 4. 過濾篩板 5. 轉(zhuǎn)移彎管 6. 過濾內(nèi)套管 7. 提取溶劑 8. 樣品收集瓶

(2) 前處理方法：基因編輯煙葉樣品，去除主干后，105 ℃ 殺青30 min，60 ℃恒溫烘干至恒重，粉碎；正常煙草樣品按YC/T 381—2010的方法制備。

將樣品萃取瓶的外套管固定在離心管架上，稱取0.25 g樣品到外套管中，加入25 mL的80%甲醇，然后把萃取瓶的內(nèi)套管卡在外套管的口部，并利用密封圈進(jìn)行固定，以防止萃取時(shí)萃取液的濺出。對外套管種的樣品進(jìn)行超聲萃取，恒溫超聲35 min。

萃取完畢，取出裝置，直接下壓在瓶口處的內(nèi)套管，萃取液直接通過內(nèi)套管的篩板進(jìn)行過濾，并進(jìn)入到管內(nèi)部，過濾的濾液從彎管管口直接流出，用色譜瓶直接進(jìn)行收集即可供色譜進(jìn)樣，操作一步實(shí)現(xiàn)樣品的過濾和轉(zhuǎn)移。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Empower 2數(shù)據(jù)工作站進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件

對煙草樣品中的糖一般采用水[24]、水—甲醇[25]、水—乙腈提取[22]，如果利用水來提取煙草，由于提取液中存在大量的酸性物質(zhì)(如檸檬酸、酒石酸等)，會導(dǎo)致蔗糖發(fā)生水解，從而影響檢測的準(zhǔn)確度[26]；據(jù)文獻(xiàn)[25]報(bào)道，采用含有甲醇的水溶液可以在一定程度上避免提取液中二糖和多糖發(fā)生水解反應(yīng)，經(jīng)試驗(yàn)采用體積比為80%的甲醇水溶液為最優(yōu)條件。因此本試驗(yàn)中不再優(yōu)化提取溶劑，直接采用文獻(xiàn)[25]優(yōu)化的提取溶劑比例。

考慮到加熱回流提取操作麻煩，所耗時(shí)間較長，不予采用；振蕩萃取和超聲萃取兩相比較，超聲萃取的效率更優(yōu)，因此本試驗(yàn)中選用超聲萃取為最佳提取方式。

試驗(yàn)表明，稱取0.25 g煙草樣品，加入80%的甲醇25 mL，超聲萃取30 min以上，煙草樣品中水溶性糖可提取完全(>98%)。因此本試驗(yàn)中選擇用80%的甲醇超聲萃取35 min。

2.2 色譜條件優(yōu)化

ACQUITY UPLC BEH Amide氨基柱是糖類物質(zhì)分析的常用色譜柱，根據(jù)試驗(yàn)需要，選用水和乙腈作為流動相，隨著乙腈比例增大，4種糖類物質(zhì)的峰型可以得到有效改善；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在流動相中添加三乙胺作為改進(jìn)劑還可抑制色譜峰拖尾。試驗(yàn)表明，用75%的乙腈(含0.2%的三乙胺)為流動相，等度洗脫即可讓待測組分達(dá)到基線分離。綜上所述，結(jié)合分離時(shí)間和分析效果，本試驗(yàn)中優(yōu)選色譜分析條件為：75%的乙腈(含0.2%三乙胺)水溶液等度分離。

ELSD是糖類物質(zhì)檢測的常用檢測器，由于糖類物質(zhì)的非揮發(fā)性，經(jīng)過ELSD會產(chǎn)生響應(yīng)的信號，因此合適的載氣量和漂移管溫度是ELSD檢測器的關(guān)鍵優(yōu)化參數(shù)。載氣量的大小會影響霧化器中液滴的形成，影響ELSD檢測器的噪音和檢測靈敏度；漂移管溫度影響了流動相和檢測物質(zhì)的氣化程度，會直接影響檢測效果和檢測限。通過信噪比比較和信號值對比，本研究優(yōu)選的檢測參數(shù)為：漂移管溫度65 ℃，氮?dú)庾鳛檩d氣，壓力241.32 kPa。

2.3 方法線性關(guān)系，檢出限和定量限

利用優(yōu)化色譜條件進(jìn)行分離，圖2為4種糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液

色譜分析圖。從圖2可看出，4種糖類物質(zhì)峰型較好，達(dá)到基線分離，分析時(shí)間大大縮短，與目前的煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相比，每個樣品色譜分離時(shí)間縮短了3倍。

配制系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定色譜條件下進(jìn)樣5 μL，根據(jù)測得的峰面積對糖的濃度(mg/mL)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，結(jié)果見表1。由表1中可以發(fā)現(xiàn)，4種糖類物質(zhì)在5～250 μg/mL時(shí)具有較好的線性，線性相關(guān)系數(shù)均>0.999，檢測限為1.0～3.2 μg/mL，可以滿足煙草樣品中4種糖類物質(zhì)的快速分析。

1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麥芽糖圖2 4種糖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 2 The chromatogram of the standards

表1 4種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限?Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients, detection limits and quantification limit of 4 analytes

2.4 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在需要考察的樣品中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液添加(樣品含量的0.5，1.0，1.5倍)，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，利用優(yōu)化的方法進(jìn)行前處理，并按選擇的色譜條件進(jìn)樣分析，每個樣品進(jìn)行7次平行測定，4種糖的回收率為91.0%～102.0%，說明方法回收率較為理想，可以進(jìn)行煙草中糖類物質(zhì)的測定分析；考察方法的重復(fù)性(N=7)，4種糖類物質(zhì)的日內(nèi)精密度為1.2%～2.5%，日間精密度為2.0%～3.0%，綜上，方法重復(fù)性較佳，穩(wěn)定性較好，適合實(shí)際樣品檢測。

2.5 實(shí)際樣品分析

選取5個基因編輯煙葉樣品(1#為水培成苗期，2#為水培現(xiàn)蕾期，3#為水培開花期，4#為水培結(jié)實(shí)期，5#為水培病化煙苗)以及正常煙葉樣品3個(6#～8#)，按照優(yōu)化的前處理方法和色譜條件進(jìn)行分離檢測，圖3為某水培成苗期新鮮煙葉實(shí)際樣品色譜圖。

從表2中可以發(fā)現(xiàn)，在苗期，煙株葉面較小，光合能力較弱，光合產(chǎn)物主要供應(yīng)煙株生長發(fā)育，因此蔗糖等化合物基本處于累計(jì)狀態(tài)；成熟期，大量淀粉累計(jì)于煙葉，還原糖等急劇升高。而水培病化煙苗樣品(5#)，果糖和葡萄糖含量是異于同期的煙苗的(1#～4#)，可能是代謝通路出現(xiàn)差異后，導(dǎo)致碳氮代謝等基礎(chǔ)代謝發(fā)生變化，可以進(jìn)行后續(xù)的深入分析。結(jié)果表明：利用建立的方法可以對煙苗期以及正常生長的新鮮煙葉中糖類物質(zhì)進(jìn)行分析檢測。方法前處理簡單易操作，分析時(shí)間大大縮短，容易實(shí)現(xiàn)批量分析，可以應(yīng)用于大量基因編輯樣品篩選評價(jià)以及后續(xù)煙葉樣品的檢測分析。

1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麥芽糖

表2 煙草樣品中4種糖的檢測結(jié)果Table 2 The results of the contents of 4 analytes in the real tobacco samples mg/g

3 結(jié)論

鑒于糖類物質(zhì)對于煙草生長情況和品質(zhì)的重要關(guān)系，本研究以基因編輯工廠化育種樣品為考察對象，以正常煙苗樣品為參照，立足于大量樣品快速分析的需求，針對目前方法存在的問題和缺點(diǎn)開發(fā)了一種新鮮煙葉中糖類化合物的快速檢測方法。結(jié)果表明：通過前處理裝置的研發(fā)和建立，可以大大簡化前處理步驟，提高前處理效率，并保證了樣品處理的穩(wěn)定性和平行性；利用超高效液相色譜分析，4種糖類物質(zhì)能在10 min內(nèi)達(dá)到基線分離，和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相比色譜分析效率提高3倍，新建立的方法的精密度、回收率均可滿足煙草樣品分析的需求。下一步將進(jìn)一步應(yīng)用于煙草基因編輯工廠化育種的評價(jià)流程中，擴(kuò)大樣本量的檢測，匯總數(shù)據(jù)，總結(jié)規(guī)律，為基因編輯功能研究提供重要數(shù)據(jù)支持和技術(shù)手段。