彭 雪 韓 瑞 陳櫟穎 王 玥 朱貴萍 曹瑞芳 鐘婷婷 申光輝 羅擎英 張志清 黎杉珊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)蜂蜜的需求量迅速增長(zhǎng)，對(duì)其食用品質(zhì)要求也越來(lái)越高[1]。蜂蜜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由Codex Alimentarius標(biāo)準(zhǔn)(CODEX Stan 12，2001)和歐盟蜂蜜指令(Council Directive，2001)定義，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蜂蜜中不應(yīng)添加任何成分[2]。然而，目前市售的蜂蜜中常會(huì)存在天然苯甲醛的殘留。苯甲醛具有苦杏仁特殊氣味，存在于無(wú)花果、杏仁等天然植物中，同時(shí)也可人工合成，被作為食品添加劑廣泛用于食品工業(yè)中[3]。由于其對(duì)眼和上呼吸道黏膜有刺激作用，對(duì)神經(jīng)有麻醉作用，能引起過(guò)敏性皮炎[4]，因此建立蜂蜜中殘留苯甲醛的檢測(cè)方法，具有十分重要的意義。對(duì)于蜂蜜中苯甲醛的檢測(cè)已有文獻(xiàn)報(bào)道，如：超聲輔助萃取和電子氣相色譜捕獲檢測(cè)(GC-ECD)、固相微萃取與氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定光譜測(cè)定(SPME-GC/MS)等[5]。這些方法雖準(zhǔn)確、可靠，但靈敏度尚有不足。近年來(lái)，化學(xué)衍生化—高效液相色譜—質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)(HPLC-MS)被廣泛關(guān)注，該方法以化學(xué)衍生試劑對(duì)分析物進(jìn)行衍生化，并采用HPLC-MS檢測(cè)，是一種具有高靈敏度的分離檢測(cè)技術(shù)，具有選擇性好，分析速度快，定性能力強(qiáng)[6]等特點(diǎn)，在痕量分析中有顯著優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)為發(fā)展高靈敏的苯甲醛檢測(cè)分析方法提供了可能。

羅丹明類化合物是一種氧雜蒽類熒光染料[7]，其基本骨架主要由帶有 3，6 位取代氨基的氧雜蒽母體(簡(jiǎn)稱母環(huán))和 9 位碳原子所連接的芳環(huán)(簡(jiǎn)稱底環(huán))兩個(gè)片段組成。羅丹明類物質(zhì)具有優(yōu)異的理化性能，是制備HPLC-MS化學(xué)衍生試劑的一種理想材料：一方面，疏水性強(qiáng)，可有效改善分析物的反相HPLC的分離效果；另一方面，摩爾消光系數(shù)高、光穩(wěn)定性好[8-10]，易霧化，易質(zhì)子化[11]，有利于提高分析物分子離子化效率，能同時(shí)放大色譜和質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)；此外，羅丹明 B 分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)季銨型的正電荷，其衍生產(chǎn)物呈現(xiàn)正離子狀態(tài)，從而提高信噪比和分析靈敏度[12]。目前，呂濤[13]曾合成了4′-羧基羅丹明，并應(yīng)用于人參二醇的質(zhì)譜增敏研究，但對(duì)醛酮類物質(zhì)的質(zhì)譜增敏研究還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)擬研究一種新型化學(xué)衍生試劑羅丹明B酰肼(Rhodamine B hydrazide，RBH)，并建立RBH柱前衍生—高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法，以實(shí)現(xiàn)蜂蜜中殘留苯甲醛含量的高靈敏檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羅丹明B(96%)(RB)：分析純，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

水合肼(98%)、苯甲醛(98%)：分析純，北京百靈威科技有限公司；

無(wú)水乙醇：色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

甲醇：色譜純，成都凌微科技有限公司；

甲酸：優(yōu)級(jí)色譜純，西格瑪奧德里奇有限公司；

洋槐蜂蜜：購(gòu)自雅安市紅旗超市；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，安捷倫科技有限公司；

質(zhì)譜儀：Agilent 6120型，安捷倫科技有限公司；

反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)：Agilent Zorbax SB-C18型，安捷倫科技有限公司；

核磁共振波譜儀：Bruker AVIII 600 MHz型，布魯克科技有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Thermo Scientific NicoletIS10型，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 RBH的合成及表征

1.2.1 RBH的合成 合成路線如圖1所示。稱取0.48 g羅丹明B溶于12 mL無(wú)水乙醇，逐滴加入85%水合肼1.2 mL，劇烈攪拌回流2 h，反應(yīng)液由深紫色變?yōu)槌吻宓牡凵７磻?yīng)液冷卻，減壓抽除溶劑。向所得的固體中加入1 mol/L HCl溶液20 mL，得澄清紅色溶液。再在攪拌條件下向溶液中慢慢滴加約1 mol/L NaOH溶液28 mL至溶液pH 9～10，將所得沉淀用6 mL超純水洗滌3次，干燥，蒸除溶劑，得到粉色固體產(chǎn)物RBH 0.45 g[14]。產(chǎn)率為93.8%。

圖1 羅丹明B酰肼(RBH)的合成路線Figure 1 Synthetic route of Rhodamine B hydrazide (RBH)

1.2.2 核磁共振氫譜表征(1H-NMR) 以氘代乙腈為溶劑測(cè)定RBH的1H-NMR，NMR譜儀質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz，TMS為內(nèi)標(biāo)，試驗(yàn)溫度為298 K。

1.2.3 傅里葉紅外光譜(FTIR)表征 用壓片法測(cè)定。以KBr為背景，壓力為15 kPa，儀器分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次[15]。

1.3 樣品前處理

稱取10 g 洋槐蜂蜜樣品(精確到0.1 g)置于100 mL三角瓶中，加入10 mL甲醇，在液體混勻器上高速混合并放置30 min以上。轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用水洗滌三角瓶，并入容量瓶中，再用超純水稀釋至刻度，混合均勻后為樣品提取溶液[16]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10.6 g苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得濃度為1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液，于低溫避光處存放。根據(jù)試驗(yàn)需要，用無(wú)水乙醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 苯甲醛的衍生化

稱取一定量RBH溶于無(wú)水乙醇，制得濃度為0.156 mol/L 的衍生化試劑。將25 mL衍生化試劑于磁力加熱攪拌下逐滴加入至0.4 mL苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液中，10 min滴完，于50 ℃水浴反應(yīng)1 h[17]，反應(yīng)液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，供HPLC-MS分析。

1.6 高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇+0.1% HCOOH；流動(dòng)相B為H2O+0.1% HCOOH；梯度洗脫0～6 min，70%～95% A，6～12 min，95% A；進(jìn)樣量5 μL；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)560 nm。

1.6.2 質(zhì)譜條件 掃描方式：電噴霧離子源(ESI)正離子掃描；檢測(cè)模式：SIM掃描；霧化氣體：N2；干燥氣流速：12.0 L/min；霧化器壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：350 ℃。以分子離子和碎片離子荷質(zhì)比定性，質(zhì)譜峰面積外標(biāo)法定量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并應(yīng)用Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 RBH的結(jié)構(gòu)表征

利用1H-NMR對(duì)合成的RBH進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究并與RB對(duì)比，表1列出了RBH和RB在CD3CN中的質(zhì)子化學(xué)位移(δH)及其位置歸屬。由表1可見(jiàn)，RBH與RB分子上各質(zhì)子的δH值及峰裂分情況有明顯差異，與RB相比，RBH在0.003 8‰ 處多出現(xiàn)一個(gè)2H的寬單峰，可歸屬于酰肼基團(tuán)中的—NH2，這一特征值可表明RB底環(huán)上的羧基已轉(zhuǎn)化為酰肼基團(tuán)，RBH合成成功。

表1 RBH、RB的核磁共振氫譜1H-NMRTable 1 Nuclear magnetic resonance spectroscopy 1H-NMR of RBH, RB

此外，對(duì)RBH還進(jìn)行了FTIR表征。如圖2所示，3 437.69 cm-1處的峰為—NH2的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 973.55，2 931.90 cm-1處的峰可歸屬于母環(huán)頂端與氮原子相連的—CH3的伸縮振動(dòng)；鄰近的一個(gè)雙峰則歸屬于—CH2— 基團(tuán)；1 697.86 cm-1處為酰胺上羰基C═O的吸收峰；1 634.53，1 615.63，1 515.08 cm-1的峰為苯環(huán)C═C鍵的特征吸收峰；1 375.61 cm-1的峰為頂端—CH3的彎曲振動(dòng)吸收峰；1 220.05 cm-1的峰歸屬于頂端叔胺取代基；1 119.05 cm-1處的峰歸屬于—C—O—C—；819.50，789.75，700.50 cm-1處的峰為取代苯C—H變形振動(dòng)的吸收峰。以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了RBH合成成功。

2.2 RBH對(duì)苯甲醛的衍生化

RBH對(duì)苯甲醛的衍生化反應(yīng)如圖3所示。酰肼類化合物可與含有羰基的醛類或酮類化合物發(fā)生親核加成反應(yīng)生成酰腙類化合物[18]，由于肼類化合物其結(jié)構(gòu)本身具有大的共軛結(jié)構(gòu)，使得生成的腙類化合物相對(duì)更加穩(wěn)定。該反應(yīng)靈敏且具有高度的選擇性，被廣泛地應(yīng)用于醛酮類物質(zhì)的標(biāo)記[19]。因此，RBH可以作為化學(xué)衍生試劑用于苯甲醛的衍生化，進(jìn)而進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)。

圖2 RBH的傅里葉變換紅外光譜圖Figure 2 Fourier transform infrared spectrum of RBH

圖3 RBH對(duì)苯甲醛的衍生化Figure 3 Derivatization of RBH and benzaldehyde

2.2.1 RBH-B的鑒定 對(duì)RBH及其與苯甲醛(RBH與苯甲醛的摩爾比為1∶1)反應(yīng)后的溶液進(jìn)行HPLC-MS分析。圖4是RBH的HPLC及MS譜圖。HPLC圖中，12.50 min處的峰是RBH的峰；MS譜圖中，m/z=457.3的峰為RBH的[M+H]+峰，m/z=229.3的峰為RBH的[M+H]2+峰，進(jìn)一步證實(shí)RBH結(jié)構(gòu)正確，合成成功。圖5是RBH-B的HPLC及MS譜圖。HPLC圖中，在9.12 min處出現(xiàn)一個(gè)新峰，而12.50 min處RBH的峰基本消失，證實(shí)衍生化反應(yīng)中RB反應(yīng)完全，有新物質(zhì)生成，且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，選擇性好，無(wú)副產(chǎn)物。通過(guò)MS譜圖對(duì)9.12 min處的峰進(jìn)行分析，其中m/z=545.3的峰可歸屬為RBH-B的[M+H]+峰，m/z=273.3為RBH-B的[M+H]2+峰，由此可判斷RBH對(duì)苯甲醛衍生化反應(yīng)是成功的。

2.2.2 衍生條件的優(yōu)化

(1) 衍生溶劑：分別采用乙腈和無(wú)水乙醇為溶劑進(jìn)行衍生化，以無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑時(shí)，反應(yīng)充分且效率高。因此，選擇無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑。

(2) 衍生溫度：分別在常溫和50 ℃水浴加熱條件下使RBH和苯甲醛完全反應(yīng)，試驗(yàn)表明，在50 ℃水浴加熱條件下，其反應(yīng)時(shí)間短，轉(zhuǎn)化率高。

圖4 RBH的HPLC及MS譜圖Figure 4 HPLC and MS spectra of RBH

圖5 RBH-B的HPLC及MS譜圖Figure 5 HPLC and MS spectra of RBH-B

(3) 衍生時(shí)間：在8 h內(nèi)研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生效率的影響。結(jié)果表明，反應(yīng)1 h時(shí)反應(yīng)效率最大且穩(wěn)定，1 h后反應(yīng)效率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變低。因此，反應(yīng)時(shí)間選定為1 h。

結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，分別測(cè)定RBH和RBH-B的色譜峰面積ARBH和ARBH-B，由ARBH-B/(ARBH+ARBH-B)計(jì)算可得衍生化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為95.2%。

2.2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 將配制的濃度為0.1 ng/mL的苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，與RBH衍生化后，進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。由于化合物RBH-B含有雜環(huán)原子，在正離子模式下易得到H+形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+。因此，本試驗(yàn)選用正離子模式。首先采用全掃描模式選擇母離子，再采用SIM掃描模式找出響應(yīng)較高的兩個(gè)碎片離子峰，對(duì)碰撞誘導(dǎo)解離等條件進(jìn)行優(yōu)化(表2)，最后選定定性離子和定量離子。

2.3 方法線性范圍、檢出限和定量限

本試驗(yàn)采用線性回歸分析，以濃度為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。采用加標(biāo)回收法測(cè)定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，分別根據(jù)最低測(cè)定濃度的信噪比S/N=3 和S/N=10 確定。結(jié)果表明，本方法在0.05～6.00 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=7 416.1X+5.03×105，相關(guān)系數(shù)為0.996 2，LOD和LOQ分別為0.80×10-3，2.71×10-3ng/mL。與已報(bào)道的方法以及GB/T 18932.14—2003中高效液相色譜熒光法(表3)相比較，本方法的LOD和LOQ明顯更低，該方法在靈敏度方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。因此，RBH柱前衍生結(jié)合HPLC-MS法可用于苯甲醛高靈敏的定量檢測(cè)。此外，RBH還可用于其他醛酮類物質(zhì)的分析檢測(cè)，對(duì)于高靈敏分析方法的開(kāi)發(fā)具有一定的理論及實(shí)踐價(jià)值。

2.4 樣品加標(biāo)回收率與精密度

加標(biāo)回收試驗(yàn)是對(duì)空白樣品進(jìn)行3個(gè)不同濃度的添加并測(cè)定，添加濃度分別為0.1，1.0，3.0 ng/mL，每個(gè)添加濃度平行測(cè)定3 次。方法精密度以3次平行結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)進(jìn)行分析評(píng)估。測(cè)得回收率為93.3%～104.0%，RSD為0.8%～2.6%，如表4所示。說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性和精密度較好。采用本方法測(cè)得洋槐蜂蜜中的苯甲醛含量為0.7 ng/mL， 蜂蜜樣品和加標(biāo)蜂蜜樣品的SIM掃描譜圖如圖6 所示。

表2 RBH-B的質(zhì)譜采集參數(shù)?Table 2 Mass spectrometry acquisition parameters for RBH-B

表3 檢測(cè)苯甲醛不同方法的線性范圍、LOD和LOQTable 3 Linear range, LOD and LOQ for different methods of detecting benzaldehyde ng/mL

表4 LC-MS法測(cè)定蜂蜜樣品中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recovery and relative standard deviations (RSD) of honey samples in LC-MS (n=3)

圖6 空白樣品和加標(biāo)樣品(3 ng/mL)中苯甲醛的SIM掃描圖Figure 6 SIM scan of benzaldehyde in sample and spiked sample(3 ng/mL)

3 結(jié)論

本研究以RB為母體，設(shè)計(jì)合成了新型酰肼類化學(xué)衍生試劑RBH。基于RBH與醛酮類物質(zhì)反應(yīng)靈敏、快速、選擇性好的特點(diǎn)，及HPLC-MS技術(shù)分析范圍廣、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，建立了RBH柱前衍生HPLC-MS聯(lián)用法對(duì)蜂蜜中的苯甲醛殘留進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，與已報(bào)道的其他方法相比，該方法具有選擇性好、靈敏度高、衍生化時(shí)間短、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，可為醛酮類物質(zhì)的檢測(cè)分析提供有利、可靠的方法，并對(duì)開(kāi)發(fā)超靈敏LC-MS新方法具有重要意義。但本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)多個(gè)醛酮類物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)，今后可以進(jìn)一步對(duì)其他醛酮類物質(zhì)衍生化，并采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行HPLC-MS測(cè)定。