張 靜 朱麗莎 張耀海 趙 靜 董 超 焦必寧,5,6

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，重慶 400712；5. 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712；6. 柑桔學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712)

中國是主要的柑橘生產(chǎn)國，柑橘栽培面積及產(chǎn)量均居世界首位，但中國柑橘產(chǎn)業(yè)仍存在早、中、晚熟品種不配套、上市期集中、加工業(yè)滯后等問題。晚熟柑橘每年1～5月成熟上市，是調(diào)整柑橘品種結(jié)構(gòu)、滿足市場周年鮮果供應(yīng)的重要品種[1]。重慶利用三峽庫區(qū)冬季無明顯凍害、柑橘可安全越冬的優(yōu)勢[2]，大力發(fā)展晚熟柑橘，正逐步成為中國最大的晚熟鮮食柑橘基地。柑橘中含有豐富的酚類物質(zhì)，主要為類黃酮和酚酸[3]。研究[4-5]表明，酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的生物活性，即抗氧化、抗炎及抗癌等保健、醫(yī)療作用。因此，酚類物質(zhì)的含量與分布也是評估柑橘果實(shí)及加工品(以果汁為主)品質(zhì)的重要指標(biāo)，并廣泛應(yīng)用于品種識別、功能性食品開發(fā)和果汁摻假鑒定等領(lǐng)域。

柑橘中酚類物質(zhì)的研究多集中在果實(shí)上，果肉作為鮮食部分，果皮和果汁作為重要的加工品[6-8]。常見的檢測柑橘中酚類物質(zhì)的方法有高效液相色譜法(High-performance liquid chromatography，HPLC)[9]及超高效液相色譜[10-11]等方法。吳桂萍[12]對柑橘果皮及果汁中主要類黃酮成分進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮苷含量豐富，果皮中多甲氧基黃酮(polymethoxylated flavones，PMFs)分布也較為廣泛。Barreca等[8]利用HPLC-MS-MS鑒定了桑吉奈落血橙汁和塔羅科血橙汁中12種類黃酮，除橙皮苷和蕓香柚皮苷外，其他物質(zhì)含量均較低。黃勝佳等[13]運(yùn)用HPLC分析四川地區(qū)8個晚熟柑橘品種中4種類黃酮和6種酚酸，僅在果肉中檢測到蘆丁及少量柚皮苷，提取酚酸僅為含量較少的自由酚酸，未對含量最豐富的橙皮苷和可溶酯化酚酸進(jìn)行測定，而且測定時間較長。

本試驗(yàn)擬以重慶地區(qū)9個主栽晚熟柑橘品種為研究材料，采用快速、高效、分離效果更好的UPLC-PDA[14-16]檢測柑橘果皮、果肉、果汁中13種類黃酮(包括3種PMFs)、7種酚酸(可溶酯化酚酸)的含量與分布，旨在為優(yōu)良晚熟柑橘品種選育、柑橘汁等加工品的質(zhì)量控制、柑橘皮等廢棄物的合理有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

晚熟柑橘：主要種植區(qū)重慶三峽庫區(qū)采集9個栽培品種，分別為沃柑、春見、大雅柑、不知火、默科特、紅肉臍橙、倫晚臍橙、紅翠2號及塔羅科血橙，隨機(jī)采取成熟無病害的柑橘果實(shí)2～3 kg。樣品詳細(xì)信息見表1。

柚皮苷(99.0%)、橙皮苷(98.0%)、咖啡酸(99.8%)：德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；

表1 柑橘樣品信息Table 1 Citrus sample information

圣草枸櫞苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷、香風(fēng)草苷、枸橘苷、橙皮素、柚皮素、桔皮素、甜橙黃酮、川皮苷、p-香豆酸、芥子酸、阿魏酸：純度>95%，美國 Chroma Dex 公司；

原兒茶酸：純度>95%，上海源葉生物科技有限公司；

對羥基苯甲酸：純度>97%，中國食品藥品檢定研究院；

香草酸：98.0%，中國藥品生物研制檢定所；

甲醇、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚：色譜純，德國CNW Technologies公司；

丙酮、乙酸和甲酸：色譜純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；

氫氧化鈉和鹽酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

超高效液相色譜儀：ACQuity型，美國 Waters 公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；

搖床：KS260型，德國IKA 公司；

高速冷凍離心機(jī)：Sigma 3K15型，美國Sigma公司；

超純水器：Millpore型，美國 Millpore 公司；

氮吹儀：WD-12型，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 用干凈紗布輕輕擦去柑桔樣品表面附著物，采用對角線分割法，取對角部分，一部分將果皮和果肉分開(寬皮橘和甜橙的果肉保留囊衣，剔除種子)，切碎、混勻，放入平行研磨儀中制成勻漿，放入分裝容器中；其他部分手工榨汁，果汁用兩層紗布過濾，塑料瓶裝。將樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

參照龔蕾[17]的方法提取類黃酮及酚酸，果汁提取步驟參照果肉。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取類黃酮和酚酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5.00 mg，用甲醇分別溶解，定容于5.00 mL棕色容量瓶中，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液。將上述母液按照要求分別稀釋到相應(yīng)的濃度。按下述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 類黃酮的色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量3.0 μL。流動相：0.2%乙酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫；流速：0.30 mL/min。波長掃描范圍200～400 nm，定量波長為283 nm(甜橙黃酮、桔皮素、川皮苷)和330 nm(其他10種類黃酮)。根據(jù)保留時間及特征吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品對照定性，外標(biāo)法定量。

1.2.4 酚酸的色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量3.0 μL。流動相：3%甲酸(A)和甲醇(B)，梯度洗脫；流速為0.30 mL/min。波長掃描范圍210～400 nm，定量波長為320 nm (咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸)和260 nm(原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸)，根據(jù)保留時間及特征吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品對照定性，外標(biāo)法定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為4次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Excel 2010、SPSS 20.0、Origin Pro 9.1軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)圖譜

類黃酮標(biāo)液色譜圖見圖1，線性范圍為0.005～50.000 mg/L，線性關(guān)系系數(shù)在0.999 8以上，測定精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率及相對偏差良好(RSD<3%)。

酚酸標(biāo)液和樣品色譜圖見圖2。線性范圍為0.01～50.00 mg/L，線性關(guān)系系數(shù)在0.999 5以上，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率及相對偏差良好(RSD<3%)。

2.2 晚熟柑橘中類黃酮物質(zhì)含量

2.2.1 果汁中類黃酮含量 目前，已從柑橘屬中分離鑒定出的類黃酮有60多種，主要分為黃烷酮、黃酮和花色苷3類，而黃烷酮是柑桔果實(shí)中含量最豐富的黃酮類化合物[18]。

不同柑橘品種果汁中類黃酮含量存在差異(P<0.05)。9種柑橘果汁中類黃酮總含量為180.83～576.78 mg/kg·FW(表2)，類黃酮總量最高的春見是紅翠2號的3.1倍。9種柑橘中均含有橙皮苷、蕓香柚皮苷、香風(fēng)草苷，以及含量極低的川皮苷和甜橙黃酮，均未檢測到圣草枸櫞苷、柚皮苷、新橙皮苷和枸櫞苷。橙皮苷占13種類黃酮平均總含量分別為：雜柑(64.6%)、臍橙(73.3%)、血橙(84.9%)，平均含量為418.23 mg/kg·FW，與文獻(xiàn)[19]結(jié)果一致，其中春見最高達(dá)446.90 mg/kg·FW。

1. 圣草枸櫞苷 2. 蕓香柚皮苷 3. 柚皮苷 4. 橙皮苷 5. 新橙皮苷 6. 野漆樹苷 7. 香風(fēng)草苷 8. 枸橘苷 9. 柚皮素 10. 橙皮素 11. 甜橙黃酮 12. 川皮苷 13. 桔皮素

圖2 7種酚酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和樣品的超高效液相色譜圖Figure 2 UPLC chromatograms of 7 phenolic acids at 260, 320 nm

2.2.2 果肉中類黃酮含量 不同柑橘品種果肉中類黃酮含量存在差異(P<0.05)。9種柑橘果肉中類黃酮總含量為946.27～2 223.83 mg/kg·FW(表3)，類黃酮總含量最高的塔羅科血橙是默科特的2.7倍。9種柑橘中均含有橙皮苷、蕓香柚皮苷和香風(fēng)草苷，3種PMFs也均有檢出，但含量較低(<2.73 mg/kg·FW)，均未檢測出柚皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。橙皮苷占13種類黃酮平均總含量分別為：雜柑(69.4%)、臍橙(75.6%)、血橙(86.3%)，平均含量為1 024.6 mg/kg·FW，其中塔羅科血橙含量高達(dá)1 919.26 mg/kg·FW，顯著高于其他品種，與Cano等[20]的結(jié)果一致(1 047 mg/kg·FW)。倫晚臍橙中香風(fēng)草苷含量最高，為146.07 mg/kg·FW，是大雅柑的8.16倍。

2.2.3 果皮中類黃酮含量 不同柑橘品種果皮中類黃酮含量存在差異(P<0.05)。9種柑橘果皮中類黃酮總含量為4 598.95～7 905.27 mg/kg·FW(表4)，其平均總含量是果肉的4.35倍，果汁的14.73倍。雜柑、甜橙和血橙均含有橙皮苷、蕓香柚皮苷和香風(fēng)草苷3種。橙皮苷仍為主要的類黃酮，在13種類黃酮平均總含量中占比分別為：雜柑(73.8%)、臍橙(84.0%)、血橙(78.2%)。蕓香柚皮苷在9種柑橘果皮中含量變幅為269.85～1 547.86 mg/kg·FW，默科特果皮含量顯著高于其他品種，是紅翠2號的5.7倍。除倫晚臍橙和紅翠2號，野漆樹苷其他品種中都有檢出。PMFs作為柑橘中的特征物質(zhì)及重要生物活性成分[21]，在果皮中含量豐富(233.8～619.4 mg/kg·FW)，川皮苷為主要的PMFs，平均含量達(dá)到247.57 mg/kg·FW；各柑橘果皮中的PMFs含量存在差異，默科特中桔皮素含量(179.25 mg/kg· FW)是紅翠2號的13.7倍。

表2 不同晚熟柑桔果汁中類黃酮的含量?Table 2 The contents of flavonoids in juice of different late-maturing citrus (n=4) mg/kg·FW

表3 不同晚熟柑桔果肉中類黃酮的含量?Table 3 The contents of flavonoids inflesh of different late-maturing citrus (n=4) mg/kg·FW

表4 不同晚熟柑桔果皮中類黃酮的含量?Table 4 The contents of flavonoids in peel of different late-maturing citrus (n=4) mg/kg·FW

2.3 晚熟柑橘中酚酸物質(zhì)含量

2.3.1 果汁中酚酸含量 根據(jù)提取方法的不同，可將所提取酚酸分為游離酚酸、酯化酚酸、糖苷化酚酸及不可溶束縛酚酸，而柑橘中的酯化酚酸占主要部分[22]。本試驗(yàn)提取的主要為可溶酯化酚酸。測定的7種酚酸根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類為原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸屬于苯甲酸型，咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸屬于肉桂酸型。

所測果汁樣品中7種酚酸物質(zhì)均被檢出(表5)。果汁中的肉桂酸型酚酸含量高于苯甲酸型酚酸，分布如下：阿魏酸66%、對香豆酸11%、芥子酸10%、咖啡酸8%，原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸所占比例不到4%。不同柑橘品種果汁中酚酸含量存在差異。沃柑果汁中阿魏酸、芥子酸的含量顯著高于其他品種，分別為69.23，12.54 mg/kg·FW，其芥子酸含量是紅肉臍橙的5.3倍；塔羅科血橙、紅翠2號果汁中對香豆酸含量高于其他品種，分別為14.98，12.10 mg/kg·FW；春見果汁中咖啡酸含量最高為9.98 mg/kg·FW；其他3種肉桂酸型酚酸的含量低于2.03 mg/kg·FW。

表5 不同晚熟柑桔品種果汁中酚酸的含量?Table 5 Phenolic acid content in the juice of different late-maturing citrus varieties (n=4) mg/kg·FW

2.3.2 果肉中酚酸含量 果肉中7種酚酸含量分布與果汁相似(表6)，分別為：阿魏酸68%、對香豆酸7%、芥子酸11%、咖啡酸9%，原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸所占比例不到5%。不同柑橘品種果肉中酚酸含量存在差異。沃柑中阿魏酸含量最高為132.02 mg/kg·FW，大雅柑最低為48.57 mg/kg·FW。沃柑、紅翠2號中芥子酸含量顯著高于其他品種，分別為22.27，21.54 mg/kg·FW；咖啡酸含量差異顯著，分布范圍為7.04～14.05 mg/kg·FW，沃柑含量最高，其次為不知火；塔羅科血橙中對香豆酸含量最高，為14.96 mg/kg·FW。香草酸含量最高的為紅肉臍橙，為3.93 mg/kg·FW；對羥基苯甲酸、原兒茶酸含量最高的為塔羅科血橙，分別為3.02，0.93 mg/kg·FW。除倫晚臍橙外，其他品種果肉中的原兒茶酸含量均低于果汁，但相差不大。

2.3.3 果皮中酚酸含量 果皮中酚酸含量豐富(表7)，平均總含量為644.45 mg/kg·FW。果皮中酚酸含量分布為：阿魏酸58%、對香豆酸19%、芥子酸6%、咖啡酸13%，原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸所占比例約為4%。默科特果皮中酚酸總含量最高，其次依次為春見、大雅柑、沃柑、不知火、塔羅科血橙、紅翠2號、倫晚臍橙、紅肉臍橙。不同柑橘品種果皮中酚酸含量差異較顯著(P<0.05)。默科特中阿魏酸含量顯著高于其他品種(555.01 mg/kg·FW)，紅肉臍橙含量最低；沃柑中對香豆酸含量為200.75 mg/kg·FW，高于其他品種?？Х人岷坎町愶@著，變幅為9.63～270.26 mg/kg·FW，其中春見、大雅柑、不知火尤其高于其他品種，這可能與3種雜柑均由清見橘橙與寬皮橘雜交而來有關(guān)。紅肉臍橙中芥子酸含量為60.33 mg/kg·FW，顯著高于其他品種。其他3種苯甲酸型酚酸含量稍高于果肉及果汁。

2.4 不同品種柑橘酚類物質(zhì)分析

不同品種晚熟柑橘中類黃酮與酚酸的組成和含量存在差異。晚熟橙類和雜柑果實(shí)中類黃酮均以橙皮苷為主，其次為蕓香柚皮苷、香風(fēng)草苷及3種PMFs。除倫晚臍橙和紅翠2號外，其他品種均檢測到野漆樹苷。雜柑中橙皮苷占13種類黃酮總含量的72%以上，甜橙、血橙中占比高達(dá)80%以上。眾多研究結(jié)果[23-25]表明橙皮苷是大多數(shù)柑橘的主要黃酮類化合物。在9種晚熟柑橘中肉桂酸型酚酸的含量高于苯甲酸型酚酸，且以阿魏酸為主，這與江萍等[26]、沈妍[27]的結(jié)論一致。不同柑橘品種中芥子酸、對香豆酸和咖啡酸的含量排列順序有所不同。黃勝佳等[13]的試驗(yàn)結(jié)果中阿魏酸含量較低(果皮為2.92～6.08 mg/kg·FW)，這與酚酸的提取方法有直接關(guān)系，本試驗(yàn)提取的酚酸為可溶酯化酚酸，而黃勝佳等[13]提取的酚酸僅為自由酚酸(幾乎只含有綠原酸)。

表6 不同晚熟柑桔果肉中酚酸的含量?Table 6 Phenolic acid content in theflesh of different late-maturing citrus varieties (n=4) mg/kg·FW

表7 不同晚熟柑桔果皮中酚酸的含量?Table 7 Phenolic acid content in the peel of different late-maturing citrus varieties (n=4) mg/kg·FW

另外，血橙中各類黃酮物質(zhì)含量均高于臍橙；雜柑果皮中咖啡酸含量高于芥子酸，而橙類恰恰相反；雜柑果皮中野漆樹苷、咖啡酸、阿魏酸及川皮苷含量高于臍橙和血橙，這可能與雜柑由寬皮橘雜交而來有關(guān)。已有研究[26]表明，不管是可溶性還是結(jié)合性酚酸，寬皮橘果皮中的咖啡酸含量都高于橙類。

2.5 同一品種不同組織部位酚類物質(zhì)分析

各品種果皮、果肉、果汁間類黃酮和酚酸的種類差異較小，但含量差異顯著。9種柑橘酚類物質(zhì)含量分布均為：果皮>果肉>果汁。果皮中類黃酮的平均總含量為6 125.0 mg/kg·FW，是果肉的4.35倍，果汁的14.73倍；酚酸平均總含量為644.45 mg/kg·FW，是果肉的6.09倍，果汁的11.26倍。果皮中含有豐富的PMFs(233.8～619.4 mg/kg·FW)，而果肉、果汁中3種PMFs含量均較低(<4.26 mg/kg·FW)。張元梅等[28]的研究表明溫州蜜柑和椪柑果皮中均含有川皮苷、桔皮素和甜橙黃酮，川皮苷含量較豐富，而果肉中則僅檢測到微量的川皮苷。Gorinstein等[29]的研究表明果皮中的阿魏酸、芥子酸、對香豆酸和咖啡酸含量明顯高于果肉中的。柑橘果皮中酚類化合物的含量豐富，可作為廉價易得的生物活性物質(zhì)資源(如作為天然抗氧化劑)用于食品和制藥行業(yè)[30]。

3 結(jié)論

本研究利用UPLC技術(shù)，分析比較了柑橘主產(chǎn)區(qū)重慶市9種晚熟柑橘品種果皮、果肉、果汁中主要類黃酮和酚酸的成分和含量。在9個晚熟柑橘果汁樣品中，沃柑果汁中阿魏酸、芥子酸含量最高，春見果汁中橙皮苷、咖啡酸含量最高；果肉樣品中，沃柑的阿魏酸、咖啡酸、芥子酸含量最高，塔羅科血橙的橙皮苷、對香豆酸含量最高；果皮樣品中，默科特果皮中類黃酮總含量最高，蕓香柚皮苷、香風(fēng)草苷含量高于其他品種，同時也是PMFs的良好來源。本研究為篩選優(yōu)良品種調(diào)整柑橘品種結(jié)構(gòu)、評估健康價值、識別加工果汁摻假等提供數(shù)據(jù)支撐，以期提高柑橘綜合利用價值、促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

本試驗(yàn)由于成本及時間問題，未對所檢測的酚類物質(zhì)進(jìn)行更準(zhǔn)確的定性驗(yàn)證；其次，果實(shí)成熟度、不同產(chǎn)區(qū)及采后儲藏等因素對酚類物質(zhì)的含量也有影響。目前，色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)既能發(fā)揮色譜法的高分離能力，又能發(fā)揮質(zhì)譜法的高鑒別能力，正逐步發(fā)展為活性成分分析中的主流技術(shù)。今后可利用色譜—質(zhì)譜聯(lián)用及高分辨率質(zhì)譜(飛行時間質(zhì)譜)等技術(shù)對晚熟柑橘中的未知酚類物質(zhì)以及其他活性成分(類胡蘿卜素、生物堿等)進(jìn)行定性、定量研究，分析其規(guī)律，對晚熟柑橘栽培、產(chǎn)地溯源和功能成分的開發(fā)利用具有重要意義。