李 俊，許桂清，劉一平

糖尿病是威脅人類健康最重要的非傳染性慢性病之一，以血管內(nèi)皮功能紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化為特征的血管并發(fā)癥是糖尿病誘導(dǎo)心血管事件，導(dǎo)致死亡的主要原因。大量研究顯示，氧化應(yīng)激在血管內(nèi)皮損傷和動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而炎癥貫穿于血管病變的整個(gè)過程[1-2]，因此，降低血管氧化應(yīng)激，緩解炎癥對(duì)糖尿病并發(fā)癥的防治具有非常重要的作用。

近年多項(xiàng)研究表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）對(duì)血管具有保護(hù)性作用。SIRT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上高度表達(dá)，對(duì)抑制動(dòng)脈硬化，降低血管氧化應(yīng)激和炎癥具有重要意義[3]。白藜蘆醇是一種植物多酚類混合物，最初發(fā)現(xiàn)來源于紅葡萄酒，是SIRT1最重要的激動(dòng)劑，在治療心血管和代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。除此之外，規(guī)律性運(yùn)動(dòng)同樣可以降低慢性炎癥，改善血糖平衡，對(duì)血管起到保護(hù)作用[4-5]。有研究顯示，運(yùn)動(dòng)能夠增加骨骼肌、肝臟等組織SIRT1蛋白表達(dá)和活性[6-7]，但有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)SIRT1在血管組織中表達(dá)作用的研究還鮮有報(bào)道，運(yùn)動(dòng)是否可以通過SIRT1機(jī)制來改善糖尿病血管炎癥還無法確定。因此，本課題為進(jìn)一步揭示SIRT1在有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇改善糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激和炎癥中的作用，對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行8周有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇干預(yù)，并基于SIRT1信號(hào)軸來探討有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激和炎癥的影響機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡清潔型Sprague Dawley大鼠42只[合格證號(hào)：SCXK（閩）2012-0002]，體重210～260 g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度和濕度分別控制在22～24oC和50%～70%，12 h晝夜循環(huán)。

1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)選取7只作為正常組對(duì)照組，并以普通飼料喂養(yǎng)，其余35只采用高脂飼料喂養(yǎng)（64.8%基礎(chǔ)飼料，15%豬油，15%蔗糖，5%蛋黃粉，0.2%膽酸鈉），制作糖尿病模型。4周高脂飼料喂養(yǎng)后，禁食12 h，30 mg/kg劑量，大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液），正常對(duì)照組注射相應(yīng)容量的檸檬酸緩沖液。STZ注射2周后，空腹血糖值大于11.1 mmol/L確定為糖尿病，最終符合糖尿病模型大鼠共29只。造模成功后，糖尿病組大鼠繼續(xù)以原先配制的高脂飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 研究設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組（Normal Con，NC）7只，糖尿病組分為4組：糖尿病對(duì)照組（Diabetes Control，DC）7只；糖尿病運(yùn)動(dòng)組（Diabetes Swimming，DS）7只，進(jìn)行8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)；糖尿病白藜蘆醇處理組（Diabetes Res，DR）7只，進(jìn)行8周白藜蘆醇處理；糖尿病白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)聯(lián)合干預(yù)組（Diabetes Res Swimming，DRS）8只，同時(shí)給予8周白藜蘆醇和有氧運(yùn)動(dòng)處理。

1.2.2 給藥方法 采用腹腔注射白藜蘆醇，劑量為30 mg/kg/d，每周監(jiān)控大鼠體重變化，并根據(jù)體重變化調(diào)整藥物用量。

1.2.3 運(yùn)動(dòng)方案 正式游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)前，所有運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行1周時(shí)間的適應(yīng)性游泳練習(xí)。正式運(yùn)動(dòng)干預(yù)方法為1 h/d，5 d/week，共8周游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷設(shè)計(jì)為：前4周無負(fù)荷游泳，后4周負(fù)重1%體重。游泳池為圓形塑料桶（直徑60 cm，高75 cm），水深45～50 cm，水溫控制在32～34oC，每桶同時(shí)容納3只大鼠。游泳過程中時(shí)刻觀察游泳大鼠的狀態(tài)，防止出現(xiàn)大鼠溺水淹死等意外發(fā)生。

1.2.4 樣本制備 大鼠最后一次干預(yù)結(jié)束后24 h處死，處死前禁食12 h。大鼠血液樣本4oC、3 500 r/min離心10 min，取上清液，-20oC保存。迅速剝離主動(dòng)脈放入冷凍管中，置于-80oC儲(chǔ)存待用。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 空腹血糖檢測(cè) 大鼠禁食12 h，尾部取血，使用血糖儀和血糖試紙（羅氏卓越血糖儀及配套試紙）檢測(cè)大鼠血糖。

1.3.2 糖耐量實(shí)驗(yàn) 大鼠禁食12 h，按2 g/kg劑量腹腔注射葡萄糖溶液，注射后分別在第0、30、60、120 min進(jìn)行血糖測(cè)定，并記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1.3.3 血清樣本檢測(cè) 甘油三酯（TC）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（南京建成生物工程研究所），胰島素（Insulin）、白介素-1β（IL-1β）和血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）采用ELISA檢測(cè)法測(cè)定（南京建成生物工程研究所），上述指標(biāo)檢測(cè)方法均對(duì)照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.4 血管超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）濃度檢測(cè) 首先，將主動(dòng)脈按1∶9比例加入生理鹽水，研磨，制作10%組織勻漿液；其次，采用BCA法測(cè)量組織勻漿液的蛋白濃度（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；最后，按照SOD和MDA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作（南京建成生物工程研究所），并根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算出組織勻漿液SOD活性和MDA濃度。

1.3.5 Western Blotting 將主動(dòng)脈和裂解液混合放入勻漿器中進(jìn)行研磨，提取主動(dòng)脈總蛋白。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，高溫變性，并置于-80oC保存待用。制備濃縮膠和分離膠，將蛋白樣品注入到上樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜1.5 h。取膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗SIRT1、核因子相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶－1（HO-1）、抑制子kappa B（IκBα）、NADPH氧化酶4（NOX4）和GAPDH（Abcam，美國(guó)）4oC孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光顯色、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異分析采用one-way ANOVA，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 大鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

8周干預(yù)后，禁食12 h，按2 g/kg劑量腹腔注射葡萄糖溶液，觀測(cè)大鼠0、30、60和120 min血糖變化（見圖1A）。所有組大鼠在第30 min血糖值達(dá)到最高水平，然后逐漸降低。在第30 min時(shí)，DC組血糖值最高，其次是DS、DR、DRS組，NC組血糖最低。在120 min時(shí)，DC組與其他組相比，仍處于較高的血糖水平。GlucoseAUC0-2h值反應(yīng)了機(jī)體調(diào)節(jié)血糖平衡的能力，GlucoseAUC0-2h值越大，說明調(diào)節(jié)血糖能力越低，相反，值越小，調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)。所有糖尿病組GlucoseAUC0-2h值均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），其中DC組最高，與其他干預(yù)組相比，在統(tǒng)計(jì)上具有顯著性差異（P＜0.01），干預(yù)組之間GlucoseAUC0-2h值雖然存在一定差異，但沒有統(tǒng)計(jì)性意義（見圖1B）。

圖1 大鼠糖耐量測(cè)試結(jié)果（Mean±SEM，n=6/group）Figure1 The Result of Glucose Tolerance Test in Rats（Mean±SEM，n=6/group）

2.2 大鼠糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)

8周實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，大鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素敏感指數(shù)和血脂指標(biāo)顯示，DC組體重最大，而DR和DRS組與糖尿病對(duì)照組相比體重較輕，但沒有統(tǒng)計(jì)性差異；糖尿病組FBG均顯著高于正常對(duì)照組，干預(yù)組FBG均低于糖尿病對(duì)照組，但僅DRS組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DC和DR組FINS明顯高于NC組（P＜0.01，P＜0.05），DRS組與DC組相比，F(xiàn)INS明顯較低（P＜0.05）；糖尿病組胰島素敏感指數(shù)（ISI）顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01），DRS組ISI明顯高于DC組（P＜0.05）；在血脂指標(biāo)上，DC組TG、TC和LDL-C均明顯高于NC組（P＜0.05），干預(yù)組3項(xiàng)血脂均低于DC組，但僅DRS組具有統(tǒng)計(jì)性意義（P＜0.05），DC組HDL-C明顯低于NC組（P＜0.05），而干預(yù)組HDL-C水平均高于DC組，但僅DRS組具有明顯差異（P＜0.05）（見表1）。

2.3 大鼠血管SIRT1蛋白表達(dá)

8周干預(yù)后血管SIRT1蛋白表達(dá)水平顯示，DC和DS組SIRT1表達(dá)水平顯著低于NC組（P＜0.05，P＜0.01），DS、DR和DRS組SIRT1蛋白表達(dá)水平明顯高于DC組（P＜0.05，P＜0.01）（見圖2）。

表1 大鼠體重、血糖、胰島素和血脂指標(biāo)（Mean±SEM）Table1 The Indicators of Weight，Blood Glucose，Insulin and Serum Lipid（Mean±SEM）

圖2 大鼠血管SIRT1蛋白表達(dá)（Mean±SEM，n=6/group）Figure2 The Protein Express of SIRT1 in Aorta of Rats（Mean±SEM，n=6/group）

2.4 糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激指標(biāo)

結(jié)果顯示，NC和DC組Nrf2蛋白表達(dá)最低，DS、DR和DRS組蛋白表達(dá)均顯著高于NC和DC組（P＜0.01），但3組之間沒有明顯差異；HO-1是Nrf2的下游蛋白，DC組大鼠HO-1蛋白表達(dá)最低，DS、DR和DRS組HO-1蛋白表達(dá)明顯高于DC組（P＜0.05）（見圖3）。

結(jié)果顯示，NC組大鼠血NOX4蛋白表達(dá)水平最低，均明顯低于其他4組（P＜0.05，P＜0.01），而DC組表達(dá)最高；DS、DR和DRS組NOX4蛋白表達(dá)均明顯低于DC組（P＜0.05，P＜0.01）（見圖4）。

圖3 大鼠血管Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)（Mean±SEM，n=6/group）Figure3 The Protein Express of Nrf2 and HO-1 in Aorta of Rats（Mean±SEM，n=6/group）

圖4 大鼠血管NOX4蛋白表達(dá)水平（Mean±SEM，n=6/group）Figure4 The Protein Express of NOX4 in Aorta of Rats（Mean±SEM，n=6/group）

8周干預(yù)后大鼠血管SOD活性和MDA水平顯示，DC組SOD活性明顯低于NC組（P＜0.05），DRS組大鼠血管SOD活性最高，均高于其他4組大鼠（P＜0.05）；DC組MDA水平明顯高于NC組，DS和DRS組MDA水平明顯低于DC組（P＜0.05），DS、DR和DRS組之間沒有明顯差異（見圖5）。

圖5 大鼠血管SOD活性和MDA水平（Mean±SEM，n=7/group）Figure5 The Level of SOD and MDA in Aorta of Rats（Mean±SEM，n=7/group）

2.5 大鼠血清IL-1β和VCAM-1指標(biāo)

8周干預(yù)后，對(duì)大鼠血清白介素-1β（IL-1β）和血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DC組血清IL-1β濃度顯著高于NC組（P＜0.01），DS、DR和DRS組大鼠IL-1β濃度顯著低于DC組（P＜0.05，P＜0.01），其中DRS組大鼠血清IL-1β水平最低，與DS組相比，具有明顯差異（P＜0.05）；DC組VCAM-1濃度最高，顯著高于NC組（P＜0.01），DS組明顯低于DC組（P＜0.01），DR和DRS組VCAM-1水平均顯著低于DC和DS組（P＜0.01）（見圖6）。

2.6 糖尿病大鼠血管IκBα蛋白表達(dá)

8周干預(yù)后大鼠血管炎癥信號(hào)IκB蛋白表達(dá)顯示，DC組表達(dá)最低，DS、DR和DRS組大鼠血管IκB蛋白表達(dá)均明顯高于DC組（P＜0.05，P＜0.01），DS組表達(dá)低于NC組（P＜0.05），DRS組表達(dá)高于DS組（P＜0.05）（見圖7）。

圖6 大鼠血清IL-1β和VCAM-1濃度（Mean±SEM，n=7～8/group）Figure6 The Serum Concentration of IL-1β and VCAM-1 in Rats（Mean±SEM，n=7～8/group）

圖7 大鼠血管IκBα蛋白表達(dá)（Mean±SEM，n=6/group）Figure7 The Protein Express of IκBα in Aorta of Rats（Mean±SEM，n=6/group）

3 討論與分析

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

白藜蘆醇具有心血管保護(hù)作用，是SIRT1最重要的激動(dòng)劑。SIRT1作為一種能量感受器，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，如胰島素分泌、肝臟糖異生和脂肪酸氧化。研究顯示，SIRT1敲除或抑制可以通過干擾胰島素受體磷酸化和糖原合成損害胰島素信號(hào)[8]。相反，肝臟SIRT1過表達(dá)能夠緩解肝性脂肪變性，改善胰島素敏感性，導(dǎo)致葡萄糖代謝平衡的改善[9]。SIRT1可以直接對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生作用，促進(jìn)血糖吸收和利用[10]。本研究顯示，給予白藜蘆醇處理能夠緩解糖尿病大鼠糖耐量受損，降低空腹血糖，提高胰島素敏感性，進(jìn)一步說明SIRT1在改善胰島素分泌，調(diào)節(jié)血糖平衡中的積極作用。除此之外，數(shù)據(jù)也顯示了有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇均能上調(diào)糖尿病大鼠血管SIRT1蛋白表達(dá)，同時(shí)對(duì)調(diào)節(jié)血糖平衡具有一定的作用，尤其是有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)對(duì)降低糖尿病大鼠血糖，提高胰島素敏感性表現(xiàn)出更為明顯的改善效果。

SIRT1還參與脂肪細(xì)胞的聚集，調(diào)節(jié)脂肪代謝。在肥胖小鼠中，脂肪組織SIRT1表達(dá)較低，導(dǎo)致脂肪酸利用率降低。SIRT1上調(diào)可以減少脂肪儲(chǔ)存，增加脂肪酸氧化。高脂飲食小鼠給予白藜蘆醇處理可以增加脂肪分解，改變血脂平衡，減緩體重的增加[11-12]。本研究顯示，給予白藜蘆醇處理的糖尿病大鼠血清TG、TC和LDL-C濃度降低，HDL-C升高，體重降低，雖然在數(shù)據(jù)上沒有表現(xiàn)出明顯的變化差異，但仍然可以看出，白藜蘆醇在血脂代謝上所發(fā)揮的作用。有氧運(yùn)動(dòng)也顯示出類似的效果，而有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)卻能夠明顯改善糖尿病大鼠血脂代謝，但其機(jī)制還并不清楚，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激的影響

白藜蘆醇能夠增加血管舒張功能，減少血管平滑肌增生，防止動(dòng)脈粥樣硬化[13]，其作用主要?dú)w因于SIRT1的抗氧化和抗炎癥特性。目前，體內(nèi)外研究表明，白藜蘆醇能夠降低ROS生成，上調(diào)內(nèi)源性抗氧化基因和血管保護(hù)分子基因表達(dá)[14]。但研究顯示，SIRT1直接抗氧化效應(yīng)并不強(qiáng)，主要是通過作用于下游轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性[15]。SIRT1可以通過調(diào)節(jié)NOX和Nrf2來影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。

3.2.1 SIRT1/Nrf2信號(hào)在改善糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激中的作用 Nrf2屬于CNC家族成員，是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。在正常生理?xiàng)l件下，Nrf2與Keap1結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，位于胞漿中的Nrf2被泛素化，并被蛋白酶體降解，使Nrf2處于較低的水平。當(dāng)Keap1受到親電物質(zhì)、自由基、重金屬等物質(zhì)時(shí)，Nrf2與Keap1分離，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，促使NQO1、HO-1、SOD等抗氧化酶基因的表達(dá)[16]。Nrf2還能夠?qū)ρ軆?nèi)皮起到保護(hù)性作用，主要是通過其下游因子HO-1發(fā)揮作用。HO-1屬于抗氧化物質(zhì)，其主要功能是將血紅素降解為CO分子、亞鐵離子和膽綠素，膽綠素通過膽綠素還原酶生成具有抗氧化功能的膽紅素[17]，同時(shí)HO-1誘導(dǎo)的CO可以激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，增強(qiáng)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，對(duì)血管具有保護(hù)作用[18]。目前，越來越多的證據(jù)表明，Nrf2激動(dòng)劑可以預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥，Keap1-Nrf2系統(tǒng)在糖尿病發(fā)病機(jī)制和并發(fā)病中發(fā)揮重要的作用[19]。

本研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇均能明顯上調(diào)糖尿病大鼠血管Nrf2蛋白表達(dá)，盡管正常對(duì)照組和糖尿病對(duì)照組血管Nrf2蛋白表達(dá)水平較低，可能是由于正常生理?xiàng)l件下Nrf2受到Keap1抑制而處于較低水平。除此之外，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇還能夠上調(diào)糖尿病大鼠血管Nrf2下游因子HO-1蛋白表達(dá)，但對(duì)血管SOD活性影響較小，同樣可以推測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇可能激活了糖尿病大鼠血管Nrf2/ARE信號(hào)通路，提高血管組織的抗氧化能力。

有研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2活性及下游NQO1和HO-1基因表達(dá)隨白藜蘆醇呈劑量性增加，白藜蘆醇處理明顯緩解高脂喂養(yǎng)Nrf2過表達(dá)小鼠血管氧化應(yīng)激，改善血管內(nèi)皮功能，而對(duì)Nrf2敲除小鼠的血管保護(hù)作用消失，認(rèn)為Nrf2信號(hào)通路在SIRT1介導(dǎo)的血管保護(hù)效應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。目前已有大量報(bào)道顯示，SIRT1/Nrf2信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥的積極作用。B.ZHANG等[21]通過激活糖尿病心肌損傷大鼠SIRT1/Nrf2信號(hào)降低心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，增強(qiáng)心肌功能。E.N.KIM等[22]通過白藜蘆醇激活SIRT1/Nrf2信號(hào)，促進(jìn)下游HO-1和SOD抗氧化基因表達(dá)，改善了腎損傷衰老小鼠腎臟功能、炎癥和細(xì)胞凋亡。這些研究與本研究結(jié)果類似，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇均能明顯上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)，并激活Nrf2信號(hào)，說明有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇可能通過激活糖尿病大鼠SIRT1/Nrf2信號(hào)通路，增加血管抗氧化能力。

3.2.2 SIRT1/NOX4信號(hào)在改善糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激中的作用 脈管系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多ROS，激活NF-κB炎癥信號(hào)，誘導(dǎo)炎癥基因的表達(dá)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管發(fā)生紊亂。NOX4是脈管系統(tǒng)中ROS最主要的來源之一，主要表達(dá)在血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞[23]。研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中和心臟病等心血管疾病都表現(xiàn)出較高的NOX4水平[24]。NOX4上調(diào)能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

目前研究報(bào)告顯示，SIRT1可以通過調(diào)節(jié)NOX4來影響細(xì)胞內(nèi)ROS生成[25]。M.J.ZARZUELO等[26]采用SIRT1抑制劑明顯增強(qiáng)NOXs活性，及其亞基p22和NOX4mRNA表達(dá)，增加ROS生成，而給予白藜蘆醇處理可以預(yù)防這一結(jié)果的發(fā)生。這些研究與本研究結(jié)果相似，8周白藜蘆醇干預(yù)明顯抑制糖尿病大鼠血管NOX4蛋白表達(dá)，同時(shí)降低了糖尿病大鼠血管MDA濃度。近年來有學(xué)者從NOX4角度研究運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)血管氧化應(yīng)激的作用，大部分研究顯示，運(yùn)動(dòng)能夠降低病理性血管NOX4表達(dá)。S.TOUATI等[27]研究顯示，12周有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低高脂飲食肥胖大鼠主動(dòng)脈NOX2和NOX4的活性及蛋白表達(dá)。本研究數(shù)據(jù)同樣顯示了類似的結(jié)果，8周有氧運(yùn)動(dòng)抑制血管NOX4蛋白表達(dá)和MDA濃度，緩解血管氧化應(yīng)激。因此可以推測(cè)，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇可能通過激活SIRT1信號(hào)，抑制NOX4表達(dá)來降低糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激。

綜上所述，NOX4和Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡的2個(gè)重要因子，NOX4與Nrf2之間的失衡可能破壞細(xì)胞氧化還原的平衡狀態(tài)。糖尿病血管組織細(xì)胞表現(xiàn)為氧化與抗氧化平衡的嚴(yán)重失調(diào)，而有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇均能降低糖尿病血管NOX4蛋白表達(dá)和MDA濃度，同時(shí)激活Nrf2信號(hào)及下游HO-1表達(dá)，尤其是有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)表現(xiàn)出更為明顯的抗氧化效果，說明有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇可能通過激活SIRT1信號(hào)調(diào)節(jié)Nrf2和NOX4之間的平衡，緩解糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激。

3.3 SIRT1/NF-κB信號(hào)在白藜蘆醇和有氧運(yùn)動(dòng)改善糖尿病大鼠血管炎癥中的作用

大量研究顯示，規(guī)律性有氧運(yùn)動(dòng)能夠緩解炎癥反應(yīng)[28]。本研究也顯示了類似的結(jié)果，8周有氧運(yùn)動(dòng)降低了糖尿病大鼠血清IL-1β和VCAM-1水平。實(shí)驗(yàn)選取血清IL-1β和VCAM-1作為血管炎癥指標(biāo)，其中IL-1β反映了機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)，VCAM-1是血管特異性分泌的細(xì)胞粘附分子，是反映血管炎癥的主要指標(biāo)。除此之外，研究數(shù)據(jù)還顯示了，給予白藜蘆醇處理能夠明顯降低糖尿病大鼠血清IL-1β和VCAM-1濃度，說明白藜蘆醇同樣具有抗炎作用。目前已有大量研究表明，SIRT1是免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)器，在許多組織中能夠抑制炎癥[29-30]。SIRT1過表達(dá)或白藜蘆醇處理能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟炎癥水平[31]。A.CSISZAR等[32]報(bào)道了給予Res處理能夠緩解吸煙誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈炎癥反應(yīng)，包括炎癥信號(hào)的抑制，降低炎癥介質(zhì)，如細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。

SIRT1的抗炎作用與炎癥信號(hào)NF-κB有關(guān)。NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是炎癥反應(yīng)中最重要的信號(hào)通路，該信號(hào)參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)凝血和促炎基因的表達(dá)，在糖尿病血管并發(fā)癥和動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB亞基p50和p65形成二聚物與IκB以失活的方式結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到ROS或促炎因子等刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)被激活，細(xì)胞質(zhì)中p65與IκB分開，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活下游TNF-α、VCAM-1和IL-1β等炎癥基因的表達(dá)[33]。NF-κB p65并不能真正反映NF-κB信號(hào)的激活，因此，對(duì)糖尿病大鼠血管NF-κB p65抑制劑IκB進(jìn)行檢測(cè)顯示，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇均能上調(diào)IκB蛋白表達(dá)，抑制了p65向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，且大鼠血清IL-1β和VCAM-1濃度均有明顯的下降，說明有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇可能抑制了NF-κB炎癥信號(hào)，降低下游炎癥基因的表達(dá)。

大量研究表明，SIRT1可以通過抑制NF-κB信號(hào)來影響炎癥反應(yīng)，SIRT1是NF-κB的潛在抑制劑。SIRT1過表達(dá)能夠降低高脂飲食小鼠肝臟NF-κB活性及下游炎癥因子表達(dá)[34]，肝臟SIRT1特異性敲除能夠激活高脂飲食小鼠肝臟NF-κB信號(hào)[35]，SIRT1過表達(dá)可以預(yù)防高糖誘導(dǎo)的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)的激活，降低內(nèi)皮細(xì)胞損傷[36]。前期研究同樣顯示，8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)能夠激活SIRT1/NF-κB信號(hào)，緩解糖尿病大鼠血管炎癥[37]。SIRT1抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要通過2種方式：SIRT1通過去乙?；疪elA/p65 Lys310，促進(jìn)p65與IκB結(jié)合，抑制NF-κB活性[38]；SIRT1通過降低細(xì)胞核內(nèi)CBP/P300乙?；D(zhuǎn)移酶的活性來降低核內(nèi)p65乙酰化水平，減弱p65與DNA的結(jié)合，并促進(jìn)p65轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)與IκB結(jié)合[39]。從上述的研究結(jié)果來看，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇上調(diào)SIRT1和IκB蛋白表達(dá)，降低炎癥因子，可以推測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇可能通過激活SIRT1信號(hào)來抑制NF-κB炎癥信號(hào)。因此可以認(rèn)為，有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇有可能是通過激活SIRT1/NF-κB信號(hào)通路機(jī)制來緩解糖尿病大鼠血管炎癥。

4結(jié) 論

有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇及聯(lián)合干預(yù)能夠有效改善糖尿病大鼠血糖代謝平衡，降低血管氧化應(yīng)激，緩解血管炎癥。其機(jī)制可能與SIRT1有關(guān)，SIRT1對(duì)Nrf2與NOX4信號(hào)以及NF-κB信號(hào)的調(diào)節(jié)，可能在有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇改善糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激和炎癥中發(fā)揮積極的作用。