蔣新龍 蔣益花 王純潔 朱志友 金文浩 沈佳琦

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

石榴在我國大部分地區(qū)都有種植，石榴皮富含石榴多酚，但大部分都被丟棄。石榴多酚含有多個(gè)酚羥基，有較高的還原性，是一種天然無毒的抗氧化劑，具有抗氧化、抗衰老等多種生理和藥理活性[1-2]，但在光照、高溫等條件下容易被破壞，從而降低藥效且浪費(fèi)資源。如何最大程度地保持石榴多酚的抗氧化能力、防止其自氧化，成為石榴多酚在食品、醫(yī)藥和日用化學(xué)品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵難題。

多孔淀粉是由淀粉經(jīng)人工方法處理而使顆粒呈現(xiàn)多孔狀，具較大的比表面積和吸附性能，可作為微膠囊芯材、吸附載體和包埋劑[3-4]。多孔淀粉對吸附質(zhì)起到類似于“包埋”的作用，可有效防止石榴多酚自氧化。本文選擇玉米多孔淀粉作為石榴多酚的吸附載體，研究多孔淀粉對石榴多酚的吸附工藝、吸附熱力學(xué)規(guī)律和吸附機(jī)理，并測定復(fù)合物的抗氧化活性，為多孔淀粉對石榴多酚抗氧化能力的保護(hù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴皮：亳州典世堂藥業(yè)銷售有限公司；玉米淀粉：山東濟(jì)南市歷城區(qū)順鑫化工經(jīng)營部；α-淀粉酶(根據(jù)GB 8275—2009[5]方法測定α-淀粉酶酶活，測得α-淀粉酶酶活為1 698 IU/mL)、糖化酶(根據(jù)GB 8276—2006[6]方法測定糖化酶酶活，測得糖化酶酶活為1.19×104IU/g)：江蘇省奧谷生物科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑皆為分析純；所用水為蒸餾水。

UV-9100紫外可見光譜儀：北京瑞利公司；pHS-3B型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-110X往復(fù)式水浴恒溫培養(yǎng)振蕩器：江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；300 kV高分辨透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F30 S-Twin)：荷蘭Philips-FEI公司。

1.2 方法

1.2.1 多孔淀粉的制備

實(shí)驗(yàn)利用復(fù)合酶-間歇超聲制備多孔淀粉。具體方法：1)將玉米淀粉原料分散到pH為5.0的檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖溶液，調(diào)制成質(zhì)量濃度為33.3%的淀粉乳A；2)預(yù)熱處理：將淀粉乳A移入到帶攪拌器和冷凝器收集裝置的密閉反應(yīng)器內(nèi)，攪拌并加熱到55 ℃，保持15 min，淀粉顆粒受熱發(fā)生膨脹制得淀粉乳B；3)酶解處理：在淀粉乳B中加入0.4%的葡萄糖淀粉酶復(fù)合酶(糖化酶:α-淀粉酶9:1)，酶解10 h；其中，在酶解過程中進(jìn)行間歇超聲處理30 min，每30 min處理1次；4)酶解終止處理：酶解結(jié)束后立即加入占緩沖液體積10%的NaOH溶液(4%)終止反應(yīng)；5)酶解終止后處理：將物料用蒸餾水洗至中性并抽濾，然后60 ℃常壓干燥、粉碎過篩，控制含水量<12%，制得多孔淀粉產(chǎn)品。

1.2.2 石榴多酚的制備

采用微波法提取石榴皮多酚(簡稱石榴多酚)。精密稱取干燥、粉碎過80目篩的石榴皮粉末→微波醇提(微波功率288 W，乙醇體積濃度40%，料液比1:30 g/mL，提取時(shí)間40 s)→過濾→多酚樣品液。

1.2.3 多孔淀粉對石榴多酚吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取25 mL一定濃度的石榴多酚溶液于250 mL的三角燒瓶中，用0.1 mol/L HC1或NaOH調(diào)至預(yù)定pH值，加入一定量的多孔淀粉作為吸附劑，置于水浴振蕩培養(yǎng)器恒溫振蕩吸附一定時(shí)間后，過濾分離。采用Folin-Ciocalteu比色法(FC法)測定石榴多酚含量[7]。以多孔淀粉對石榴多酚的吸附量為衡量指標(biāo)。

吸附量qe=(C0-Ce)V/M

式中：qe為平衡時(shí)在吸附劑上的吸附量/mg/g；V為溶液的體積/L；M為吸附劑的質(zhì)量/g；C0為初始質(zhì)量濃度/mg/L；Ce為吸附平衡時(shí)溶液中質(zhì)量濃度/mg/L。

1.2.4 多孔淀粉對石榴多酚吸附條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)：固定初始條件其他量不變，采用控制變量法，考量pH、吸附時(shí)間、吸附劑用量、石榴多酚初始質(zhì)量濃度、吸附溫度幾個(gè)因素，分別設(shè)置pH梯度1.0、2.0、30、4.0、5.0、6.0、7.0；吸附劑用量梯度10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg/L；石榴多酚質(zhì)量濃度梯度為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg·mL-1；時(shí)間梯度為15、30、45、60、90、120 min；溫度梯度為30、35、40、45、50 ℃。測定多孔淀粉對石榴多酚的吸附量。

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：參照單因素實(shí)驗(yàn)以吸附劑用量、石榴多酚濃度、時(shí)間、pH為影響因素，進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。吸附條件優(yōu)化的最終衡量標(biāo)準(zhǔn)是石榴多酚的吸附量，以石榴多酚吸附量最大時(shí)的條件為最優(yōu)吸附條件。分別選取pH為2、3、4；時(shí)間60、90、120 min；吸附劑用量10、20、30 mg/L；石榴多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0、6.0、7.0 mg/g。

1.2.5 吸附性能測定

在最優(yōu)吸附條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別用模型進(jìn)行模擬，求得動(dòng)力學(xué)參數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)(ΔG0、ΔH0和ΔS0)及最大吸附量等吸附性能參數(shù)[8]。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 多孔淀粉與石榴多酚復(fù)合物制備及抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

取一定量多孔淀粉在最佳吸附條件下吸附石榴多酚，冷凍干燥后制得復(fù)合物，采用Folin-Ciocalteu比色法[7]測得石榴多酚含量為3.808 mg/g。

DPPH·法是用以評價(jià)天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏可行的方法[9-10]。根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法采用DPPH體系下清除自由基的方法，將石榴多酚和復(fù)合物分別置于24 ℃恒溫室內(nèi)自然光(平均光強(qiáng)3 000 lx)、強(qiáng)日光(平均光強(qiáng)85 000 lx)條件下進(jìn)行光降解對照實(shí)驗(yàn)。每隔1 d測定對DPPH·自由基的清除率，以對DPPH·自由基的清除率的保存率P(%)為衡量指標(biāo)，監(jiān)測其抗氧化能力的變化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理均重復(fù)3次。清除率的保存率P=(Y0-Y)/Y0×100%，式中：Y0和Y分別為處理前后樣品對DPPH·自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔淀粉的制備

從原玉米淀粉和多孔淀粉的掃描電鏡(SEM)成像分析結(jié)果(圖1)可以看出，原淀粉采用多孔化制備工藝后，在淀粉顆粒表面形成了大量的多孔結(jié)構(gòu)，且多孔的形成不僅僅是在淀粉表面，在淀粉的內(nèi)部也有孔隙形成，這樣的疏松多孔結(jié)構(gòu)，使比表面積明顯增大，從而顯著增大了對石榴多酚的吸附效果。

圖1 原玉米淀粉和多孔淀粉的掃描電鏡圖

2.2 多孔淀粉對石榴多酚吸附條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由于石榴多酚在結(jié)構(gòu)上存在酚性羥基，在酸性條件下比較穩(wěn)定。圖2可知，當(dāng)pH<7時(shí)，隨著pH值的增大，多孔淀粉對石榴多酚的吸附量逐漸減??；隨著多孔淀粉用量的不斷增加，加大了吸附表面積，同時(shí)也增加了參與吸附的位點(diǎn)，但單位多孔淀粉的吸附量在不斷減小；隨著吸附時(shí)間和石榴多酚濃度的不斷增加，多孔淀粉對石榴多酚的吸附量也逐漸增大直至達(dá)到吸附飽和。由圖2可知，當(dāng)吸附溫度為40 ℃時(shí)吸附量最大，但與30 ℃水平差異不顯著，所以吸附溫度固定為30 ℃。

圖2 多孔淀粉對石榴多酚吸附單因子實(shí)驗(yàn)

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表頭，對其中主要因子pH值(A)、吸附時(shí)間(B)、吸附劑用量(C)、石榴多酚初始質(zhì)量濃度(D)4因子在3個(gè)不同水平進(jìn)行優(yōu)選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析表

注：F0.01(2、2)=99.00，“**”表示因素影響極顯著。

結(jié)果采用直觀分析和方差分析，以得出多孔淀粉對石榴多酚的最佳吸附條件。表1中K1、K2、K3為每個(gè)因素3次實(shí)驗(yàn)所得的吸附量的平均值。R為平均數(shù)的極差，R越大表明變化幅度大，說明該因素的水平變化對吸附量的影響越大，該因素即是最大影響因素。由表1可知，影響吸附量的因素主次依次排列為：吸附劑用量>初始質(zhì)量濃度>pH值>吸附時(shí)間。由表2可知吸附劑用量對吸附量的影響極顯著，其他因素對吸附量的影響則不顯著。直觀分析，實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A1B1C1D1；根據(jù)每個(gè)因素K1、K2、K3，實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A1B2C1D1。吸附時(shí)間對吸附量的影響不顯著且最小，綜合正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，確定最佳工藝條件為A1B1C1D1，即吸附溫度30 ℃，pH值2，吸附時(shí)間1h，吸附劑用量10 g/L，初始質(zhì)量濃度5 000 mg/L。

2.3 吸附性能測定結(jié)果

2.3.1 吸附動(dòng)力學(xué)性能

表3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.2 吸附熱力學(xué)性能

吸附熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^研究吸附等溫線，確定多孔淀粉體對石榴多酚的最大吸附量及對石榴多酚的吸附熱力學(xué)特性。通常采用Langmuir吸附等溫吸附模型(Ce/q=1/KLqmax+Ce/qmax)和Freundlich吸附等溫吸附模型(lgqe=lgKF+lgCe/n)進(jìn)行分析[8]。

根據(jù)優(yōu)化條件，將不同濃度石榴多酚溶液分別在30、40、50 ℃進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，模擬分析結(jié)果見表4。表中qmax為吸附劑最大吸附量，K、1/n為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。由2個(gè)方程的線性相關(guān)系數(shù)r值可以判定2個(gè)方程都擬合良好，但更符合Freundlich吸附等溫吸附模型。多孔淀粉吸附石榴多酚的Langmuir方程擬合相關(guān)系數(shù)rL達(dá)到0.971 3～0.996 0，由此可推測多孔淀粉對石榴多酚的吸附為單層吸附。多孔淀粉吸附石榴多酚的Freundlich方程擬合相關(guān)系數(shù)rF為0.995 4～0.998 8，K為0.142 5～0.210 9，n為1.296 8～1.314 3，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附是自發(fā)吸附[12]。30、40、50 ℃時(shí)的最大吸附量分別可達(dá)到341.102 4、363.048 0、326.106 2 mg/g，優(yōu)于明膠微球等吸附材料[13-14]。

在以上等溫吸附模型中，可根據(jù)吸附等溫式常數(shù)K，計(jì)算吸附熱力學(xué)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)自由能變?chǔ)0、焓變?chǔ)0、熵變?chǔ)0及平衡平衡常數(shù)KC[8]。從表5可知，ΔG0、ΔH0均為負(fù)值，說明多孔淀粉吸附石榴多酚過程是自發(fā)的，而且是放熱的。ΔG0介于-29.73～-31.09 kJ/mol，而一般化學(xué)吸附的ΔG0介于-80～-400 kJ/mol，說明該過程主要是物理吸附作用。ΔH0為-9.17 kJ/mol，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附是弱放熱過程，而|ΔH0|<25 kJ/mol也說明了該吸附主要是物理過程。ΔS0值則說明吸附反應(yīng)的進(jìn)行增加了系統(tǒng)的混亂程度。

表4 吸附等溫線

表5 熱力學(xué)參數(shù)

2.4 多孔淀粉與石榴多酚復(fù)合物的抗氧化活性

多孔淀粉與石榴多酚復(fù)合物的人工光熱降解對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，石榴多酚的光降解與光照強(qiáng)度、光照持續(xù)時(shí)間等因素有關(guān)，光照強(qiáng)度越大、光照持續(xù)時(shí)間越長，抗氧化活性的保存率越低。相同光照強(qiáng)度和光照時(shí)間，低濃度石榴多酚復(fù)合物的抗氧化活性保存率比石榴多酚保存率高。

圖3 光照對抗氧化活性的保存率的影響

3 討論

通過正交實(shí)驗(yàn)得到對吸附影響力順序從大到小排列為吸附劑用量>初始濃度>pH值>吸附時(shí)間。吸附劑用量對吸附量的影響極顯著，其他因素對吸附量的影響則不顯著。ΔH0為-9.17 kJ/mol，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附以物理吸附包埋、范德華力、靜電吸附為主。因?yàn)槭亲园l(fā)的弱放熱過程，因此溫度對吸附的影響不顯著。由于石榴多酚在酸性條件下比較穩(wěn)定，在堿性條件易發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，但pH對弱放熱過程的物理吸附影響不明顯，pH在單因素實(shí)驗(yàn)中可以觀察到，對石榴多酚吸附量的影響也不大，正交實(shí)驗(yàn)對于pH的影響沒有顯著性。

一般情況下，一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程通常只適用于吸附的初始階段，二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型是建立在整個(gè)吸附平衡時(shí)間范圍內(nèi)。研究表明吸附動(dòng)力學(xué)行為同時(shí)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(R2>0.99)和二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(R2>1.00)。但更符合二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)吸附模型。同樣，研究表明吸附過程同時(shí)符合Langmuir吸附規(guī)律(R2>0.94)和Freundlich吸附規(guī)律(R2>0.99)，但更符合Freundlich吸附等溫吸附模型。Langmuir模型的前提是假設(shè)固體表面是均勻的，為單層表面吸附；Freundlich吸附等溫式是基于吸附質(zhì)在多相表面上的吸附。由此可推測多孔淀粉對石榴多酚的吸附主要為多相表面上的吸附。Freundlich等溫線中n代表Fueundlich方程參數(shù)，并被Powell等[15]認(rèn)為與吸附劑-吸附質(zhì)之間吸附推動(dòng)力密切相關(guān)。計(jì)算求得n=1.30左右，表明多孔淀粉對石榴多酚的吸附較慢[16]。這與吸附時(shí)間在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全吻合。

對石榴多酚和復(fù)合物光降解對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在自然光下兩者差異不明顯，但在強(qiáng)光下5 d后，石榴多酚抗氧化活性保存率降低了5.83%，而石榴多酚與多孔淀粉復(fù)合物僅下降了3.53%。這說明多孔淀粉對石榴多酚的抗氧化活性有一定的保護(hù)作用，與駱慧敏等學(xué)者的研究結(jié)果一致[17-18]。

4 結(jié)論

通過四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)對多孔淀粉對石榴多酚的吸附條件進(jìn)行優(yōu)化，得到吸附的最佳條件為：吸附時(shí)間60 min，吸附溫度30 ℃，溶液pH為2.0，石榴多酚質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL。在該條件下，得到石榴多酚的實(shí)際最大吸附量為225.84 mg/g，與Langmuir等溫曲線擬合所得的理論最大吸附量341.10 mg·g-1有差異。主要原因在于正交實(shí)驗(yàn)沒有考慮各影響因子的交互作用。

多孔淀粉對石榴多酚的吸附更符合Freundlich吸附等溫吸附模型，其動(dòng)力學(xué)行為更符合二級(jí)反應(yīng)速率方程。對表觀熱力學(xué)參數(shù)表明，其吸附主要是一個(gè)自發(fā)放熱的物理吸附過程。

人工光降解對照實(shí)驗(yàn)表明，多孔淀粉在保護(hù)石榴多酚的抗氧化能力方面有較好的作用。

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