王子洋，范利鋒，王永千，李進(jìn)海，周 橋，黃 嵐，王忠義

0 引 言

在植物中發(fā)現(xiàn)生物電現(xiàn)象已經(jīng)有 100多年的歷史，國內(nèi)外學(xué)者在植物電信號檢測和分析研究上做了很多工作[1-4]。植物電的研究對象從以捕蠅草、含羞草以及跳舞草等具有明顯葉片活動的高敏感度植物為主[5-6]，已經(jīng)延伸到模式植物擬南芥，小麥、玉米等作物[7-10]，以及蘆薈、燕子掌等觀賞性植物[11]；其信號類型從機(jī)械刺激出捕蠅草的動作電位，到以燒傷、光照、鹽刺激誘導(dǎo)的變異電位，以及局部電位為主[12-15]；其檢測技術(shù)從用非極化金屬電極刺入植物中引出接觸部位整體的電位變化，到使用玻璃微電極引出細(xì)胞膜內(nèi)電位變化，以及用多電極陣列、熒光染料標(biāo)記探索群體電信號胞間傳遞[16-17]。二十世紀(jì)初，科學(xué)家們主要使用電流計（galvanometer）來探索植物興奮的電活動[5-6,18]。通過對電生理領(lǐng)域的不斷探索和電子技術(shù)的發(fā)展，大部分研究人員們開始使用放大器（electronic amplifier and potentiometer）來對電位進(jìn)行檢測[1-6]。由于植物產(chǎn)生的電信號頻率極低，一般不對檢測系統(tǒng)添加高通濾波器（即交流耦合方式）進(jìn)行信號采集和處理[2,5]。在2000年以后，國內(nèi)與國外個別研究組使用了交流耦合方式對植物進(jìn)行靜息信號的采集與分析[11,19-21]。

在植物電生理領(lǐng)域中，目前最小的研究單位是具有運(yùn)輸離子功能的膜蛋白，如鉀離子通道，質(zhì)子泵等。植物電信號的本質(zhì)是離子跨膜運(yùn)動所導(dǎo)致細(xì)胞極化程度變化。已有的研究表明，許多生理過程都伴隨著細(xì)胞膜極化程度的改變，如：植物的光合作用，呼吸作用，化學(xué)遞質(zhì)分泌等[22-23]。高等植物的電活動絕大多數(shù)都是通過環(huán)境變化進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括溫度、光照等環(huán)境因素變化均可以誘導(dǎo)出植物電信號。植物的電活動現(xiàn)象更加傾向于是對環(huán)境變化的反饋。植物細(xì)胞不同于動物心肌等細(xì)胞，植物電生理領(lǐng)域的研究中，并未確鑿發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生自發(fā)的、短時間間隔且具有明顯節(jié)律性的電信號，這甚至在植物電生理領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生過爭論[24]。對植物的節(jié)律研究主要圍繞晝夜節(jié)律和光照節(jié)律對植物本身的影響[25-26]，也有快速自發(fā)的節(jié)律性微弱信號在植物中被發(fā)現(xiàn)，但相關(guān)研究甚少[27]。

國內(nèi)外學(xué)者對植物電信號的頻率分布集中在 10 Hz以內(nèi)已有共識[5,8,21]，然而在信號幅度上，國內(nèi)部分研究者對植物電信號幅度量級是微伏級還是毫伏級存在疑惑[21]。因此，本文通過小麥和含羞草作為試驗樣品，以光誘導(dǎo)局部電位和燒傷誘導(dǎo)變異電位為例，探討并描述了直流耦合模式記錄數(shù)據(jù)與交流耦合模式記錄數(shù)據(jù)幅度區(qū)別，同時依據(jù)信號功率密度時頻分布來闡述信號的頻率分布，討論了記錄模式中影響較大的噪聲源，分析了 2種耦合記錄模式對抗噪聲方面各自的特點(diǎn)，最后對信號可信度進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料選擇與培養(yǎng)

試驗樣品采用德抗 961品種的小麥（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供）和易記錄電信號的敏感性植物含羞草。用10%次氯酸鈉溶液對小麥種子浸種消毒15 min，用去離子水沖洗3～6遍。以去離子水在暗處浸種12～24 h后，選擇萌發(fā)一致的種子置于培養(yǎng)皿中的發(fā)芽紙上，加去離子水以濕潤發(fā)芽紙，每天更換溶液和發(fā)芽紙。室溫下培養(yǎng)，光暗周期為14（光）/10（暗）h，溫度周期為28/26 ℃，相對濕度60%，萌發(fā)4～5 d后進(jìn)行試驗；含羞草為室內(nèi)自然光下培養(yǎng)，土培（草炭土：珍珠巖：蛭石=3：1：1體積比）溫度周期26/20 ℃，3～4月齡，主枝長度可達(dá)30 cm。

1.2 信號采集

使用自制Ag-AgCl電極作為記錄電極和參比電極，方法詳見參考文獻(xiàn)[28]，使用萬向微操縱器（STW-3C，成都儀器廠，中國）控制記錄電極，以產(chǎn)生微小位移。整體試驗在自制防震臺上，如圖1c所示。記錄電極以及參比電極位置如圖1a，1b所示。在記錄電極與活體樣品（小麥葉片，含羞草葉柄）的接觸部分，使用0.5%瓊脂，5 mmol/L氯化鉀膠質(zhì)進(jìn)行電極與樣品接觸點(diǎn)耦合處理，圖1a中兩處虛線部分均為耦合膠質(zhì)，以減小接觸噪聲。圖1b中參比電極浸入在0.2%瓊脂，5 mmol/L氯化鉀的移液管中，插進(jìn)土中作為電位參考點(diǎn)[28]。使用高阻抗放大器（SWF-1B，成都儀器廠，中國）進(jìn)行信號前置放大，再將其輸出端接到生理信號采集系統(tǒng)（RM6240BD，成都儀器廠，中國）進(jìn)行信號采集，采樣頻率200 Hz，交流耦合模式下時間常數(shù)可以設(shè)置為5、1、0.1、0.01和0.001 s。通過上位機(jī)軟件進(jìn)行信號分析，繪圖等[29-30]，整體試驗示意圖如圖1c所示。在記錄過程中，針對同一個記錄電極，連接直流耦合擋位和交流耦合擋位，同步進(jìn)行信號記錄，交流耦合檔的時間常數(shù)為1 s，即下限截止頻率為0.16 Hz。交流耦合的原理是在記錄直流信號的基礎(chǔ)上，增加了高通濾波器。在試驗中，電極漂移的影響會隨記錄時間的增長而變大，為了避免電極漂移對信號產(chǎn)生影響，小麥光照電位采集時間控制在5 h以內(nèi)，含羞草試驗中，電位記錄控制在10 min以內(nèi)。信噪比計算方法使用公式（1）進(jìn)行計算，其中Vs為信號峰峰值，Vn為基線噪聲峰峰值[9]。

1.3 信號誘導(dǎo)方法

在光照誘導(dǎo)局部電位試驗中，光源（MHAA-100W，MORITEX，日本）放置在法拉第屏蔽網(wǎng)外。通過鵝頸式光纖（A08400，MORITEX）將光打到小麥樣品正上方，該方法可以有效地隔離光源中鹵鎢燈熱輻射對小麥電信號的影響。試驗環(huán)境溫度保持在27～28 ℃之間，葉表溫度維持在 26～27 ℃之間。試驗過程中使用強(qiáng)度約為144 μmol/m2s的光照進(jìn)行持續(xù)刺激，在刺激之前需要保持10～30 min的暗處理。燒傷誘導(dǎo)含羞草變異電位試驗中，使用火焰外焰接觸含羞草最外側(cè)葉尖部進(jìn)行熱刺激來誘導(dǎo)變異電位，并同步錄制視頻（小蟻運(yùn)動相機(jī)，小蟻科技，中國），通過查看試驗的視頻記錄，可知熱刺激時間約為0.3 s。

1.4 信號阻滯方法

在光誘導(dǎo)小麥電信號試驗中，使用帶有鈣離子通道阻滯劑[17,31]的膠質(zhì)（0.5%瓊脂，5 mmol/L氯化鉀，10 mmol/L氯化鑭）與葉片相接觸，如圖1a所示，在試驗過程中，使用帶有阻滯劑的膠質(zhì)放置在記錄電極連接處（見圖 1a中虛線內(nèi)），進(jìn)行阻滯4 h后再記錄電信號。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對直流耦合記錄模式采集的植物電信號做 STFT（short-time Fourier transform）變換，用來實(shí)現(xiàn)信號功率密度時頻分布圖。這樣，不但可以清晰地探明植物電信號的主要功率頻率分布，而且可以根據(jù)輸入信號的種類不同，來查詢不同時間段的頻率分布，可以和交流耦合記錄模式進(jìn)行相互比較。該方法如公式（2）所示。

圖1 小麥和含羞草電信號誘導(dǎo)試驗方法及原理Fig.1 Schematic diagram of electrical signal recording in wheat and Mimosa

式中 x(τ)代表輸入信號，h(τ-t) 代表窗函數(shù)，τ表示窗函數(shù)寬度。目前該方法已在心電領(lǐng)域?qū)π囊粜盘栠M(jìn)行處理等[32-33]。我們使用MATLAB 2016a中的spectrogram（xt，window （win_width），overlap，nfft，fs）函數(shù)進(jìn)行功率密度時頻分布圖繪制。在保證高時間分辨率和頻率分辨率的前提下選用漢明窗（hamming）作為窗函數(shù)。其中win_width= 1 000，overlap=0.5*win_width，nfft=1 024，fs=100，即以窗寬為1 000樣點(diǎn)（10 s），交疊數(shù)為500（5 s）的漢明窗，頻率分辨率為0.097 Hz（fs/nfft），做短時傅立葉變換。

2 結(jié)果與分析

分別對光誘導(dǎo)的小麥局部電位和燒傷誘導(dǎo)的含羞草變異電位進(jìn)行了 3次重復(fù)記錄。小麥局部電位試驗中，直流耦合檔和交流耦合檔記錄到的信號均具有較高重復(fù)性；含羞草變異電位波形雖然重復(fù)性不高，但是其功率分布頻率具有穩(wěn)定性。

2.1 含羞草與小麥電信號直流耦合與交流耦合同步記錄

圖2a，2b為小麥光誘導(dǎo)局部電位。光照刺激后，直流耦合記錄信號峰-峰值約為69 mV，而交流耦合記錄信號中峰-峰值只有約2.7 mV，直流耦合記錄信號變化幅度遠(yuǎn)大于交流耦合記錄信號。其他波形參數(shù)包括持續(xù)時間、斜率等均具有明顯差異。在小麥直流耦合記錄的信號功率密度時頻分布圖中，可以觀察到全時間段信號的主要功率分布在0.2 Hz以內(nèi)，而在光照刺激后最初的前100 s中，存在0.2 Hz至1 Hz之間的少量的功率分布。這個結(jié)果與交流耦合記錄到的數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的一致性。以0.16 Hz作為截止頻率的交流耦合記錄方式濾掉了絕大部分的有效信息。

如圖2c，2d所示，含羞草燒傷變異電位功率分布主要集中在0.15 Hz以下，與小麥光誘導(dǎo)局部電位信號特征相似，電信號功率分布均集中在低頻范圍內(nèi)。交流耦合記錄的信號峰-峰值約33 mV，直流耦合記錄的信號的去極化幅度約為70 mV。在25至30 s之間20 dB以上的功率強(qiáng)度已達(dá)到0.6 Hz。雖然功率的頻率分布要明顯高于光誘導(dǎo)下的局部電位數(shù)據(jù)，但是0.1 Hz以內(nèi)依然占有超過50%的功率分布。在變異電位的記錄中，使用0.16 Hz為截止頻率的交流耦合記錄模式也會濾掉絕大部分的有效信息。

從小麥的光誘導(dǎo)局部電位信號和含羞草燒傷誘導(dǎo)的電位信號中可以發(fā)現(xiàn)，無論是用直流耦合模式和交流耦合模式都可以對信號進(jìn)行采集，但信號的波形和強(qiáng)度有所差異。事實(shí)上交流耦合所記錄到的數(shù)據(jù)是在直流數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上經(jīng)過了高通濾波，交流記錄數(shù)據(jù)與直流耦合記錄數(shù)據(jù)在數(shù)值上是微分關(guān)系。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，使用直流耦合記錄模式可以更加全面的反應(yīng)植物緩慢的電活動。交流耦合記錄模式雖然放大了快變的電信號，但是遺漏了植物電活動中的緩慢變化。在信號幅度上，直流耦合記錄的信號幅度基本維持在幾十毫伏的量級。交流耦合記錄到的信號幅度則要小于直流耦合記錄的結(jié)果，尤其是慢變化的光誘導(dǎo)的局部電位。

圖2 小麥和含羞草電信號直流耦合與交流耦合同步記錄Fig.2 DC(direct current) coupled and AC(alternating current) coupled electrical signal recording synchronously in wheat and Mimosa

2.2 交流耦合模式不同下限截止頻率下小麥局部電位記錄

為了進(jìn)一步研究不同耦合方式對信號采集的影響，對小麥光照產(chǎn)生的電信號同時進(jìn)行 4路通道的采集，如圖 3所示，分別為直流耦合模式，0.03、0.16和 1.6 Hz下限截止頻率的交流耦合模式。結(jié)果顯示下限截止頻率越高，所記錄到的信號幅度越低。在圖3a的直流耦合數(shù)據(jù)中，4 min以后的緩慢變化的信號在交流耦合模式中均未有明顯變化。在記錄剛進(jìn)行光照刺激時的快變信號時，交流耦合模式的信號變化更加劇烈。

2.3 含羞草變異電位傳導(dǎo)與小麥局部電位阻滯

我們需要通過藥理學(xué)方法或其他方式進(jìn)行驗證所記錄到的植物電信號是植物本身的電活動而非電極噪聲或是環(huán)境干擾。針對燒傷誘導(dǎo)含羞草的變異電位，我們使用信號傳導(dǎo)的方式來進(jìn)行驗證。記錄電極1與記錄電極2的固定位置如圖1b所示。圖4a、4b是含羞草變異電位2根記錄電極的直流耦合與交流耦合記錄結(jié)果，從結(jié)果可知，直流耦合與交流耦合數(shù)據(jù)均有明顯的延遲現(xiàn)象，可以看出信號從記錄電極1傳遞至記錄電極2。而箭頭所指為熱刺激時間點(diǎn)，在箭頭處可以看到 2根電極同時受到了干擾產(chǎn)生噪聲。

小麥光誘導(dǎo)局部電位沒有傳導(dǎo)現(xiàn)象，我們通過使用鈣離子通道阻滯劑氯化鑭對小麥進(jìn)行處理，在使用氯化鑭處理前記錄一組光誘導(dǎo)局部電位數(shù)據(jù)，然后對小麥葉片進(jìn)行處理4 h，在4 h后再記錄一組小麥光照誘導(dǎo)局部電位。箭頭指向光照開始時間點(diǎn)。在圖4c中，使用直流耦合模式記錄到的數(shù)據(jù)可以看出光照的第一個去極化波幅度有了明顯降低，圖4d的交流耦合數(shù)據(jù)中，受到氯化鑭處理的小麥所產(chǎn)生的波形幅度則產(chǎn)生明顯降低。

圖3 直流耦合與不同下限截止頻率交流耦合小麥電信號記錄Fig.3 Measurement of DC coupled and AC coupled with different lower-cut-off frequency electrical signal in wheat

圖4 植物電信號的傳導(dǎo)與阻滯Fig.4 Plant electrical signal transmission and block

3 討 論

3.1 信號噪聲來源及消除方法

植物電信號屬于微弱信號，其等效信號源輸出電阻較大，可達(dá) G?量級，因此在采集記錄電位信號時的噪聲抑制一直是個重要問題。如果僅考慮由樣本與電極構(gòu)成的通路引入的噪聲，常見的噪聲源有 50 Hz的工頻噪聲、操作員人體的靜電電荷積累所產(chǎn)生的干擾和其他環(huán)境影響。所以，在記錄植物電信號時，需要在法拉第屏蔽網(wǎng)中進(jìn)行。并且，以單點(diǎn)接地的形式將屏蔽網(wǎng)內(nèi)的夾持器等接地，試驗操作時需要帶上防靜電手環(huán)，控制環(huán)境溫濕度處于相對平衡值。

在使用直流耦合記錄時，所遇到的主要問題是氯化銀半電池的電位漂移。由于氯化銀電極周圍接觸溶液離子濃度的影響，可能產(chǎn)生幾十毫伏以上的電位漂移。這在長時間使用溶液進(jìn)行電極與樣品的耦合時容易出現(xiàn)。交流耦合記錄模式則可以減弱電極電位漂移所產(chǎn)生的影響，然而對記錄植物電信號而言，交流耦合記錄模式則更容易受到如人體接觸或者樣品輕微移動等其他噪聲源的干擾[5-6]。

3.2 兩種耦合記錄模式的電位采集分辨率

在以氯化銀電極作為傳感器的宏觀電信號記錄當(dāng)中，直流耦合記錄模式的特點(diǎn)是較寬的電壓幅度采集范圍。由于靜息電位和電極接觸電位的疊加使得基線的電位非零，并且伴隨溫度影響，最高有近700 mV的電位變化。因此，植物電信號采集系統(tǒng)的直流記錄范圍至少應(yīng)達(dá)-1 V至+1 V，才可以確保記錄基線在記錄范圍以內(nèi)。再者，直流記錄信號本身的變化范圍大，如圖2a、2c所示，信號幅度本身也達(dá)到60 mV以上，所以直流記錄需要有較大的電壓幅度記錄范圍。然而，較寬電壓幅度記錄范圍會導(dǎo)致電壓分辨率降低。

當(dāng)采用交流耦合記錄模式時，信號的直流成分（靜息電位和電極接觸電位）將被阻隔掉，只記錄電信號的變化率。記錄到的信號幅度較小，采集系統(tǒng)可采用較大的放大倍數(shù)，電壓采集分辨相對較高。從圖2a中可以看出直流耦合模式記錄到的信號已經(jīng)變化了 69 mV，而交流耦合模式記錄的信號變化范圍僅僅2.7 mV。由于信號采集范圍的縮小，則可以將小信號進(jìn)一步放大，從而提高了信號電壓采集分辨率。然而，當(dāng)有效信號達(dá)到“微伏”量級時，采集儀器系統(tǒng)噪聲，電極接觸噪聲（1/f noise），電極熱噪聲則需要考慮和排除[34-35]。

3.3 植物電信號數(shù)據(jù)記錄真實(shí)性與量級

盡管目前的一些研究在分析植物電信號時也會采用EEG（Electroencephalography）信號所用的分析方法[2,13,36-37]，但值得注意的是，植物細(xì)胞膜電位變化和植物電信號產(chǎn)生的離子機(jī)制，完全不同于動物細(xì)胞膜電位和電活動[5,22-23]。一般認(rèn)為，腦皮質(zhì)大量神經(jīng)元的突觸后電位同步總和，構(gòu)成頭皮記錄得到的腦電圖(EEG)[38-39]。所記錄腦電波的振幅主要決定于腦內(nèi)發(fā)生的電活動的強(qiáng)度和參考電極的選擇，幅度0.5 至100 μV[38-39]。由于植物細(xì)胞膜電位變化的離子機(jī)制和傳導(dǎo)機(jī)制與動物不同，所以，以交流耦合模式從植物體上記錄的微伏級電信號，到底是不是植物的自發(fā)電信號，必須在得到離子通道、胞內(nèi)記錄、微電極陣列及藥理學(xué)試驗數(shù)據(jù)的支持的情況下，才能確定其結(jié)論。

交流耦合記錄模式與直流耦合記錄模式記錄到的植物電信號波形形狀、幅度、頻率會有明顯差異，這可能使國內(nèi)外部分學(xué)者對植物電信號幅度量級產(chǎn)生了疑惑。近十幾年，國內(nèi)外多個植物電信號研究組對交流耦合模式所記錄到的植物靜息信號[20-21]，或是微伏級所謂的“低幅度信號”[19,40]進(jìn)行研究，探索植物自身電信號與環(huán)境的關(guān)系。然而，正如上文所說，通過交流耦合方式來研究微伏級的信號時，首先應(yīng)考慮如何排除掉儀器噪聲，傳感器熱噪聲，接觸噪聲與其他環(huán)境噪聲干擾。根據(jù)植物電生理領(lǐng)域自1873年以來已有的國內(nèi)外研究成果，極少發(fā)現(xiàn)隨機(jī)性的植物電信號[5-6,41]。絕大部分通過直流耦合方式記錄到的信號均可以劃分至動作電位，變異電位，系統(tǒng)電位以及局部電位這 4類范圍，而呈現(xiàn)隨機(jī)性的、通過交流耦合方式記錄到的微伏級植物電信號不同于上述 4類植物電信號。本文中通過交流耦合模式所記錄到的微伏級植物電信號均呈非隨機(jī)性，通過對比圖 3中交流與直流耦合模式記錄到的數(shù)據(jù)可知，植物的部分電活動在交流耦合模式下是難以記錄到的。

然而，國內(nèi)外所有發(fā)表的呈現(xiàn)隨機(jī)性的微伏級信號遲遲沒有對信號本身的離子機(jī)制進(jìn)行討論，并且對該類微伏級信號進(jìn)行分析的研究組呈逐年增加趨勢。因此，討論所記錄信號的真實(shí)性顯得尤為重要。為了區(qū)別植物電活動所產(chǎn)生的信號和環(huán)境噪聲，通常采用以下方式來進(jìn)行信號驗證：1）確認(rèn)采集儀器和傳感器本身的噪聲范圍，如圖2a中交流耦合數(shù)據(jù)信噪比約為36.8 dB，排除采集儀器和傳感器本身的熱噪聲與接觸噪聲。氯化銀電極的自噪聲范圍是納伏至微伏級[42-44]，并不影響測量結(jié)果。2）在記錄動作電位和變異電位中，可以使用多電極記錄方式，通過信號傳導(dǎo)來確定其真實(shí)性。因為環(huán)境噪聲干擾會同時對多電極產(chǎn)生影響，無法記錄到傳導(dǎo)現(xiàn)象。如在圖1b含羞草變異電位記錄中使用了2根記錄電極，相距4 cm來進(jìn)行信號傳導(dǎo)驗證，數(shù)據(jù)如圖4a、4b所示，2根記錄電極所記錄信號具有延時。3）局部電位不能傳導(dǎo)，需要使用離子通道阻滯劑驗證信號真實(shí)性，這是一種較為適用的方法[45]，文中小麥光誘導(dǎo)的局部電位驗證如圖4c、4d所示，在進(jìn)行4 h的鈣通道阻滯劑（氯化鑭）阻滯后部分信號幅度具有明顯降低，這與文獻(xiàn)[31]中光誘導(dǎo)植物電信號的離子機(jī)制相對應(yīng)，該方法也可以用于變異電位和動作電位的阻滯，以確認(rèn)信號的真實(shí)性。

4 結(jié) 論

本文記錄了含羞草和小麥 2種植物在不同記錄模式下的電信號，探索了不同耦合記錄模式所記錄植物體表波形數(shù)據(jù)特征。1）通過分析兩類樣品的波形幅度可知，在使用非極化金屬電極進(jìn)行植物表面電位記錄時，直流耦合記錄或者交流耦合記錄方式均可以獲得植物電信號數(shù)據(jù)，雖然所反映的是同一植物電活動，但 2種耦合方式所記錄到的植物電信號在波形、幅度上會有明顯差別。2）在記錄高等植物電信號時，使用交流耦合方式記錄可以觀察快變信號，并需要通過直流耦合信號記錄與分析確認(rèn)功率的頻率分布，以確定記錄所需的合理的下限截止頻率。3）驗證所記錄植物電信號真實(shí)性是深入研究和探索植物電活動的前提，應(yīng)使用生物以及藥理學(xué)方法來證明所記錄的信號是由植物本身產(chǎn)生，而非采集回路噪聲和環(huán)境干擾。

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