段明霞，唐其柱

(武漢大學人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學心血管病研究所，心血管病湖北省重點實驗室， 武漢 430060)

內(nèi)毒素血癥是由革蘭氏陰性菌釋放大量內(nèi)毒素而引起的一種全身炎癥反應(yīng)，可發(fā)展為中毒性休克和多器官功能衰竭等。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，屬于革蘭氏陰性菌外膜成分,具有劑量依賴性細胞毒作用，可引起嚴重的急性心肌損傷和心力衰竭。研究表明，LPS誘導(dǎo)心臟損傷而引起的病死率可達50%～60%，是重癥監(jiān)護室患者的首要死因[1,2]。因此，尋找和阻斷內(nèi)毒素血癥發(fā)生時心肌損傷的靶點，對診治和改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的非吞噬細胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase,Nox) 家族是一類廣泛分布的跨膜蛋白，最先發(fā)現(xiàn)于中性粒細胞和巨噬細胞，是體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要來源之一[3]。研究表明，Nox依賴的ROS參與調(diào)節(jié)多種心血管疾病，如缺血性心肌病、心力衰竭、高血壓和心肌炎等[4，5]。Shah等[6]通過研究證實，心臟特異性高表達Nox 4可加重血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)，而Nox 4抑制劑可顯著改善心功能，提示Nox在調(diào)控心肌重構(gòu)的過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，LPS可誘導(dǎo)心肌組織凋亡和心肌組織氧化損傷，表現(xiàn)為B細胞淋巴瘤/白血病蛋白-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)水平降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteine aspastic acid-specific protease 3, Caspase 3)、4羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)水平升高[7]。Bax為促凋亡因子，在細胞中發(fā)揮促凋亡作用[8]。Caspase 3是凋亡途徑的下游效應(yīng)部分，活化后的Caspase 3 (cleaved Caspase 3, c-Caspase 3)通過其酶解切割作用影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮促凋亡作用[9]。4-HNE是ROS與生物大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而形成的脂質(zhì)過氧化物，可反映心肌組織是否氧化損傷[10]。然而，Nox在LPS誘導(dǎo)的急性心肌損傷組織中的具體機制尚不明確。本研究探討了Nox在LPS誘導(dǎo)的急性心肌損傷組織中的表達及意義，以期為臨床治療內(nèi)毒素血癥所致的心肌損傷提供理論依據(jù)和干預(yù)靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

LPS購買于美國Sigma公司，純度>95%?？筃ox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2、c-Caspase 3和4-HNE的一抗購買于英國Abcam公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購買于美國Santa cruz公司；免疫印跡熒光標記羊抗兔二抗IRdye@800 CWIgG 購買于LI-COR公司，免疫組織化學辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購買于艾吉泰康公司。 TRIZOL和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞士Roche公司。主要的實驗儀器有超聲裂解儀、研磨儀、超高速離心機、分光光度計、酶標儀、水浴鍋、蛋白/核酸電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、搖床、封膜機、脫水機、包埋機、病理切片機、組織攤片機、烤箱、倒置顯微鏡、雙色紅外熒光成像系統(tǒng)、實時熒光定量PCR檢測儀。

1.2 實驗動物和內(nèi)毒素血癥模型構(gòu)建

所有針對動物的操作都經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院動物倫理委員會批準。本實驗采用8～10周齡無特定病原體C57/BL6J雄性小鼠(n=30)，購于北京華富康生物科技有限公司。實驗動物購回后，適應(yīng)實驗環(huán)境至少1周，隨后被隨機分為對照組和LPS組，每組15只。其中，LPS組一次性注射10 mg/kg的LPS，對照組注射等量生理鹽水。兩組小鼠均于注射后第6 h處死，取出小鼠心臟置于10%氯化鉀液，稱重后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；擬組織學方法檢測的心肌標本置于4%多聚甲醛中固定，脫水后石蠟包埋待切片。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測基因表達

取約20 mg心肌組織加入EP管中并加入1 ml TRIZOL，研磨后加入200 μl三氯甲烷，12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后吸取上清液，加入等體積異丙醇，12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后,將沉淀的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)溶于焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水中,分光光度計測定RNA濃度。當A260/A280比值在1.8～2.0，A230/A260比值>2.0即表明可用，計算RNA提取量。

通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，GAPDH作為內(nèi)參照，羅氏LightCycler480 Real-time PCR儀進行擴增并對PCR結(jié)果進行定量分析。擴增條件： 95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s、60℃ 退火8 s、72℃延伸25 s，共40個循環(huán)。目的基因以GAPDH為內(nèi)參照對其表達量進行校正。利用Primer-BLAST在線設(shè)計引物序列，由上海生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 Western blotting

從-80℃冰箱取出心臟標本，取30～40 mg心肌組織放入離心管中，加入裂解液，放入研磨儀中研磨，研磨完全后再使用超聲裂解儀裂解標本，使細胞蛋白充分釋放。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium,BCA)法測定蛋白濃度，加入相應(yīng)上樣緩沖液和水，使蛋白樣本濃度均一化，72℃水浴10 min使蛋白變性。取適量蛋白樣本放入10%基質(zhì)鈉十二烷基硫酸聚丙烯胺凝膠電泳(substrate-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)膠進行電泳分離，90 V恒壓電泳2 h。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，清洗3次后使用5%脫脂牛奶封閉1.5 h。封閉完成后4℃孵育一抗過夜。TBST緩沖液清洗膜3遍后，加入IRdye@800 CW標記的羊抗兔IgG 二抗37℃孵育1 h，清洗3遍后使用雙色紅外成像系統(tǒng)進行掃膜分析。以GAPDH為內(nèi)參照分析和計算Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2和Caspase 3蛋白表達水平。

表1 Nox 2、Nox 4、Bax和Bcl-2基因引物序列

Nox: non-phagocytic cell oxidase; Bax: Bcl-2-associated X protein; Bcl-2: B cell lymphoma/leukemia-2; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

1.5 免疫組織化學方法

60℃烤片30 min，二甲苯3次脫蠟,每次5 min，無水乙醇、95%乙醇和70%乙醇各3遍脫水。采用3%甲醇雙氧水來抑制內(nèi)生過氧化物酶的活性，并用8%羊血清封閉60 min，排除非特異性抗原?？?-HNE的一抗使用1∶100磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋，4℃過夜。隨后用PBS清洗5遍，加入辣根過氧化物酶標記二抗,繼續(xù)清洗，隨后加入二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)。每組隨機選取10個樣本，每個樣本隨機選取1個視野，采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)軟件計算4-HNE分布面積取平均值。對照組心臟組織呈灰白色，無4-HNE分泌，LPS組心臟組織可見著色的4-HNE。

1.6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡

60℃烤片30 min，二甲苯脫蠟2次，每次5 min，梯度乙醇脫水；蛋白酶K工作液37℃處理組織玻片20 min后，PBS漂洗2次，每次5 min；LPS組玻片加50 μl末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT)+450 μl熒光素標記的脫氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)液；對照組僅加50 μl熒光素標記的dUTP液；玻片干后加50 μl TdT介導(dǎo)的dUTP切口末端標記技術(shù)(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)反應(yīng)混合液于標本上，加蓋玻片在37℃中反應(yīng)1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；玻片干后加50 μl 辣根過氧化物酶標記的熒光抗體于標本上，于37℃中反應(yīng)30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；隨后滴加100 μl DAB底物，室溫反應(yīng)10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；觀察后用蘇木素復(fù)染3 s，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片，然后200倍鏡頭下拍照。每組隨機選取10個樣本，每個樣本隨機選取1個視野，采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)軟件計算心肌凋亡細胞數(shù)取平均值。正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞胞核呈致密濃染。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組心肌組織Nox 2、Nox 4、Bax和Bcl-2基因表達水平比較

相比對照組，LPS組小鼠心肌Nox2、Nox4、Bax基因表達水平明顯升高，Bcl-2基因表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖1)。

圖1 Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2基因在對照組和LPS組中的表達Figure 1 Expression of Nox 2, Nox 4, Bax and Bcl-2gene between control and LPS groupNox: non-phagocytic cell oxidase; Bax: Bcl-2-associated X protein;Bcl-2： B cell lymphoma/leukemia-2; LPS: lipopolysaccharides.Compared with control group, *P<0.05

2.2 兩組心肌組織Nox 2、Nox 4、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較

相比對照組，LPS組心肌組織Nox 2、Nox 4、 Bax蛋白表達水平明顯增加,Bcl-2蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05;圖2)。

圖2 Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白在對照組和LPS組中的表達Figure 2 Expression of Nox 2, Nox 4, Bax and Caspase 3protein in control and LPS groups

A: Western blotting results; B: quantitative analysis results. Nox: non-phagocytic cell oxidase; Bax: Bcl-2-associated X protein; Bcl-2: B cell lymphoma/leukemia-2; LPS: lipopolysaccharides. Compared with control group,*P<0.05

2.3 免疫組織化學結(jié)果比較

相比對照組，LPS組心肌組織4-HNE表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖3)。

2.5 TUNEL結(jié)果比較

相比對照組，LPS組心肌組織心肌凋亡細胞明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖4)。

3 討 論

LPS由類脂A、核心多糖和O-特異性多糖側(cè)鏈等組成，其中類脂A是LPS最主要的生物活性成分。研究表明，少量LPS刺激機體時，可通過誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生而增強機體的固有免疫功能，而大量LPS釋放入血，可激活單核-巨噬細胞，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴重時可引起彌漫性血管內(nèi)凝血和多器官功能衰竭[11]。大量研究證實，多種因素參與內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)的心功能障礙，包括氧化應(yīng)激、炎癥、心肌能量代謝和微血管功能障礙等。其中，氧化應(yīng)激被認為是誘導(dǎo)心功能障礙的主要原因[12]。已有臨床研究表明，內(nèi)毒素血癥患者氧化應(yīng)激水平與預(yù)后密切相關(guān)，且氧化應(yīng)激水平越高，預(yù)后越差[13]。內(nèi)毒素血癥發(fā)生時,機體內(nèi)超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等ROS成分大量蓄積，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能，進而引起細胞凋亡，導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙。據(jù)研究，ROS和其產(chǎn)生的氧化應(yīng)激在細胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，大量ROS可通過啟動凋亡信號來促進心肌細胞凋亡?？寡趸瘎┤鏝-乙酰半胱氨酸可抑制或延遲細胞凋亡[14]。4-HNE是一種脂質(zhì)過氧化物，通過與線粒體蛋白形成加合物對心肌發(fā)揮破壞性影響[15]。本研究結(jié)果表明一次性注射大劑量LPS誘導(dǎo)的急性心肌組織損傷模型中，心肌組織氧化損傷標志物4-HNE表達增加，表明LPS可加重心肌組織脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。

循環(huán)系統(tǒng)主要表達4種Nox亞型，而心肌細胞主要表達Nox 2和Nox 4。Nox 2主要位于內(nèi)皮細胞、心肌細胞和成纖維細胞中，生理條件下，Nox 2處于未激活狀態(tài)，不具有生物功能。 炎癥、 中毒等刺激可激活Nox 2，通過NADPH將氧分子轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x氧。研究表明，Nox2基因在人心肌梗死區(qū)域表達增加，而敲除Nox2基因可明顯改善心肌梗死小鼠的左心室功能[16，17]。而Nox 4主要通過其和游離氧的歧化作用產(chǎn)生過氧化氫，從而調(diào)節(jié)ROS的生成[18]。Matsushima等[19]發(fā)現(xiàn)特異性敲除心臟Nox4基因可減輕壓力超負荷誘導(dǎo)的線粒體和心功能障礙。此外，Sun等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)高級氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidative protein products，AOPPs)可誘導(dǎo)細胞凋亡，Nox 4、Bax蛋白表達增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降。上述研究提示Nox依賴ROS的產(chǎn)生可促進心肌細胞凋亡。本研究表明相比對照組，LPS組心肌組織促凋亡因子Nox2、Nox4、Bax基因和蛋白表達增加,抗凋亡因子Bcl-2基因和蛋白表達降低，TUNEL染色結(jié)果提示LPS組小鼠心肌組織凋亡細胞數(shù)增加，我們推測Nox依賴ROS的增加，激活相關(guān)通路，從而引起心肌細胞凋亡，而干預(yù)Nox通路有可能是治療內(nèi)毒素血癥患者的有效靶點。

圖3 免疫組織化學法檢測兩組心肌組織4-HNE表達Figure 3 Detection of 4-HNE expression in myocardium by immunohistochemistry (PAP ×200)HNE: 4-hydroxynonenal. A: control group; B: LPS group; C: quantitative analysis results. Compared with control group, *P<0.05

圖4 TUNEL法檢測心肌組織凋亡細胞Figure 4 Detection of myocardial apoptotic cells by TUNEL ( ×200)TUNEL: TdT-mediated dUTP nick-end labeling. A: control group; B: LPS group;C: quantitative results. Compared with control group, *P<0.05

本研究也存在一定的局限性：Nox是否直接通過氧化應(yīng)激來發(fā)揮作用尚需進一步探討；Nox是否通過其他途徑影響LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡尚不清楚；Nox通過何種具體機制影響LPS誘導(dǎo)的急性心肌損傷也需后期研究探討。

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