李海洋，李榮華，夏巖石，袁清華，張振臣，趙偉才，郭培國(guó)*

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）又稱(chēng)為微衛(wèi)星序列，是以1～6個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成的 DNA序列[1]，而基于其開(kāi)發(fā)出的DNA分子標(biāo)記具有特異性強(qiáng)、共顯性、穩(wěn)定性高以及操作簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到大豆、小麥、水稻等作物的遺傳研究[2-4]。雖然已有 SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草的遺傳圖譜構(gòu)建[5]、遺傳多樣性分析[6]、基因定位[7-8]等方面的研究報(bào)道，但與其他作物相比，煙草中可用的SSR標(biāo)記較少。

根據(jù) EST和基因組的 DNA序列挖掘和開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記作為傳統(tǒng)方法，在其他植物中已經(jīng)有大量應(yīng)用[9-10]，在煙草中亦有報(bào)道。如根據(jù)野生絨毛狀煙草基因組的測(cè)序結(jié)果，分析了SSR位點(diǎn)的組成、分布及特征[11]；利用3種煙草基因組信息，對(duì)SSR位點(diǎn)的分布情況進(jìn)行探索，并設(shè)計(jì)出SSR引物組合[12]；根據(jù)煙草EST序列數(shù)據(jù)分析了EST-SSR位點(diǎn)信息及分布特征，并設(shè)計(jì)了一些SSR引物組合[13-15]。但由于常規(guī)栽培的普通煙草為異源四倍體，基因組較為復(fù)雜[16]，且我國(guó)的煙草品種還存在遺傳狹窄的問(wèn)題[17]，開(kāi)發(fā)出的SSR標(biāo)記多態(tài)性水平低[16,18-19]，制約了煙草SSR標(biāo)記的利用，導(dǎo)致SSR標(biāo)記在煙草中的研究和應(yīng)用相對(duì)較薄弱。

近年來(lái)，在第2代測(cè)序基礎(chǔ)上建立的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，可利用酶切技術(shù)、序列捕獲芯片技術(shù)等其他手段降低物種基因組復(fù)雜程度，進(jìn)而了解物種部分基因組的特性。目前，主要應(yīng)用的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)包括復(fù)雜度降低的多態(tài)序列測(cè)序（complexity reduction of polymorphic sequences,CRoPS）[20]、基因分型測(cè)序技術(shù)（genotyping by sequencing, GBS）[21]、限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)的DNA測(cè)序（restriction-site associated DNA, RAD-seq）[22]。其中應(yīng)用較為廣泛的 RAD-seq是利用酶切技術(shù)降低基因組的復(fù)雜度，對(duì)酶切產(chǎn)生的RAD-tag進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠開(kāi)發(fā)大量的SNP和SSR標(biāo)記，而且具有成本低、準(zhǔn)確率高、不受參考基因組序列限制等優(yōu)點(diǎn)[23]。運(yùn)用該方法，已經(jīng)在茄子[24]、菠蘿[25]、花生[26]等其他植物上開(kāi)發(fā)出 SSR標(biāo)記并應(yīng)用于遺傳分析。

本研究利用RAD-seq技術(shù)，對(duì)兩份煙草材料進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，分析SSR位點(diǎn)的數(shù)量、重復(fù)序列次數(shù)、基序類(lèi)型，大規(guī)模開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)材料之間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，可降低具多態(tài)性SSR標(biāo)記引物篩選的工作量和成本，為多態(tài)性SSR標(biāo)記的篩選和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試4份煙草材料中“118-3”和“粵煙98”由廣東省煙草南雄科學(xué)研究所提供，“大葉密合”和“長(zhǎng)脖黃”由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。其中用于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的兩份煙草材料中，“118-3”為廣東省特色烤煙品種，“粵煙98”是趙偉才等[27]以“Coker206”為母本、“K326”為父本選育的烤煙新品種。另外兩份材料“大葉密合”和“長(zhǎng)脖黃”分別為廣東省優(yōu)良的地方曬煙品種和河南省優(yōu)良地方烤煙品種。2016年3月采取4份煙草材料的新鮮葉片，利用李榮華等[28]改良的CTAB法提取4份煙草材料基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳和微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

利用RAD-seq技術(shù)，對(duì)“118-3”和“粵煙98”兩份煙草材料的基因組DNA進(jìn)行簡(jiǎn)化測(cè)序。操作流程簡(jiǎn)述如下：選用六堿基限制性?xún)?nèi)切酶 EcoR I酶切基因組DNA，構(gòu)建RAD文庫(kù)，利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序；測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、質(zhì)檢、評(píng)估等分析，獲得各個(gè)樣品的干凈讀長(zhǎng)（clean reads）及序列數(shù)據(jù)。過(guò)濾參數(shù)如下：去除含adapter的reads，去除含N比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上）。

1.3 基因組SSR位點(diǎn)的鑒別及SSR引物的設(shè)計(jì)

利用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）version 0.7.12軟件將過(guò)濾后得到的clean reads與參考烤煙基因組K326進(jìn)行比對(duì)，利用MISA（http∶//pgrc.ikpgatersleben.de/misa）軟件在read覆蓋的參考基因組序列中查找SSR位點(diǎn)。配置參數(shù)如下：?jiǎn)魏塑账?、二核苷酸、三核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最低重?fù)次數(shù)分別為15、6、5、4、4和4，相鄰 SSR序列間隔區(qū)域長(zhǎng)度不小于100 bp。根據(jù)SSR位點(diǎn)兩翼的序列，利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)SSR引物。對(duì)兩份測(cè)序樣品中共有的 SSR位點(diǎn)進(jìn)行序列分析，若SSR位點(diǎn)在兩份測(cè)序材料之間存在重復(fù)差異即為多態(tài)性SSR。

1.4 PCR擴(kuò)增和檢測(cè)方法

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包含30 ng/μL的DNA 模板 2 μL；10×PCR Buffer 1.2 μL，10 μmol/L的正反向引物各 0.2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dd H20 6.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，適宜退火溫度45 s（退火溫度視引物的不同而改變），72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，按照郭培國(guó)等[29]改良的銀染技術(shù)進(jìn)行染色檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié) 果

2.1 煙草簡(jiǎn)化基因組序列的產(chǎn)出和質(zhì)量檢測(cè)

煙草簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果顯示，“118-3”和“粵煙98”兩個(gè)煙草樣品分別獲得45 120 744和50 362 336 clean reads，分別具有6.63 Gb和7.42 Gb的原始數(shù)據(jù)（表 1）。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、過(guò)濾，2個(gè)樣品共獲得95 480 084個(gè)高質(zhì)量干凈讀長(zhǎng)（HQ clean reads），平均Q30（測(cè)序堿基質(zhì)量值，即測(cè)序時(shí)錯(cuò)誤識(shí)別的概率是0.1%、正確率為99.9%的堿基比例）為93.99%，平均GC含量為38.78%。從表1中可以看出，過(guò)濾前后差異很小，Q30處于較高水平，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠；但GC含量處于較低水平，對(duì)本試驗(yàn)測(cè)序反應(yīng)影響不大。

表1 RAD-seq基因組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Summary of genomic sequences generated by RAD-seq

2.2 煙草簡(jiǎn)化基因組中SSR位點(diǎn)的頻率和分布

運(yùn)用BWA軟件將“118-3”和“粵煙98”簡(jiǎn)化測(cè)序獲得的clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，分別比對(duì)上44 995 698和50 187 807個(gè)reads。在此基礎(chǔ)上，利用 MISA軟件在比對(duì)到參考基因組上的reads覆蓋區(qū)域中搜索SSR位點(diǎn)，在“118-3”和“粵煙98”中分別檢測(cè)到19 746和20 340個(gè)reads含有1個(gè)或以上的SSR位點(diǎn)，其中兩份材料中共有SSR位點(diǎn)的reads數(shù)為17 941個(gè)。兩份材料中共檢測(cè)到22 145個(gè)reads上含有25 343個(gè)SSR位點(diǎn)；這些含有SSR位點(diǎn)reads中，其中有17 882（80.74%）個(gè)reads含有1個(gè)SSR位點(diǎn)，剩余的reads含有2個(gè)或以上的SSR位點(diǎn)。

在所發(fā)現(xiàn)的SSR位點(diǎn)中，完全重復(fù)型（P型）所占的比例最大，共計(jì) 23 660個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的93.35%；復(fù)合型（C型）只有 1683個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的6.65%（表2）。P型SSR位點(diǎn)中，二核苷酸類(lèi)型出現(xiàn)比例最高，達(dá) 10 513個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的41.48%；其次是三核苷酸，為 7631個(gè)（30.11%）；單核苷酸和四核苷酸的差別不大，分別為 2595（10.23%）和2108個(gè)（8.31%）；五核苷酸和六核苷酸最少，分別只有451（1.77%)和362個(gè)（1.42%）。從表2還可以看出，P型SSR位點(diǎn)中，以六核苷酸類(lèi)型重復(fù)序列的平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)，達(dá)到 26 bp；四核苷酸的平均長(zhǎng)度最短，為17 bp；C型SSR位點(diǎn)的平均長(zhǎng)度較長(zhǎng)，為28 bp。

在P型SSR位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)298種基序，出現(xiàn)頻率最高的基序是AT/TA，為5337個(gè)位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的21.06%；隨后分別為T(mén)/A（2278個(gè)位點(diǎn)，8.99%）、AG/CT（1383個(gè)位點(diǎn)，5.46%）和TC/GA（1066個(gè)位點(diǎn)，4.21%）；此外TTG/CAA（816）、AAC/GTT（834）、AAG/CTT（461）、TTA/ATT（644）、TAT/ATA（539）、TTC/GAA（881）和AAAT/ATTT（805）基序達(dá)到總SSR位點(diǎn)數(shù)的1.5%以上（表2）。

表2 煙草基因組中的SSR位點(diǎn)的分布信息Table 2 Distribution of SSR loci in the tobacco genome

2.3 煙草基因組SSR位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)

煙草不同類(lèi)型SSR位點(diǎn)基序的重復(fù)次數(shù)如表3所示。從中可見(jiàn)，單核苷酸的基序重復(fù)次數(shù)集中在15～18次，二核苷酸和三核苷酸基序重復(fù)次數(shù)主要分布在6～9次和5～8次，四核苷酸在4～6次，而五和六核苷酸基序的重復(fù)次數(shù)主要集中在4～5次。從SSR位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)來(lái)看，以6次基序重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)數(shù)最高，達(dá)到5171個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)20.4%；5次和7次重復(fù)次數(shù)分別為3945和3141個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)15.56%和12.39%。另外，從表3還可以看出，各個(gè)SSR位點(diǎn)類(lèi)型出現(xiàn)的頻率均存在隨重復(fù)次數(shù)的增加而逐漸下降的趨勢(shì)。

2.4 煙草簡(jiǎn)化基因組SSR引物設(shè)計(jì)與多態(tài)性驗(yàn)證

利用Primer 3.0軟件對(duì)25 343個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)出23 346對(duì)SSR引物，引物設(shè)計(jì)的成功率為 92.12%；根據(jù)“118-3”和“粵煙98”兩份材料的簡(jiǎn)化測(cè)序數(shù)據(jù)，初步發(fā)現(xiàn)其中有323對(duì)引物的SSR位點(diǎn)在兩份材料間具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為1.38%。

隨機(jī)選擇50對(duì)具有多態(tài)性位點(diǎn)的SSR引物，利用兩份簡(jiǎn)化測(cè)序煙草材料和另兩份煙草種質(zhì)材料對(duì)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證（圖1），SSR引物信息及驗(yàn)證結(jié)果如表4所示。從中可見(jiàn)50對(duì)引物在兩個(gè)簡(jiǎn)化測(cè)序樣品中均能擴(kuò)出清晰的條帶，其中有 38對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)率達(dá)到76%；在另兩份種質(zhì)材料中有48對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率達(dá)96%，其中有10對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)率為20%。

表3 煙草基因組中SSR位點(diǎn)的基序重復(fù)次數(shù)分布Table 3 Distribution of repeat numbers of SSR motifs in tobacco genome

圖1 部分SSR引物在4份煙草材料中擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染圖Fig. 1 Image of silver staining for PCR amplicons of partial SSR primer pairs in four tobacco genotypes

表4 50對(duì)SSR引物在4份煙草材料中擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析Table 4 Polymorphic analysis for PCR amplicons of 50 SSR primer pairs in 4 tobacco genotypes

表4 （續(xù)）Table 4 (Continued)

3 討 論

3.1 煙草簡(jiǎn)化基因組SSR位點(diǎn)分布特征

本研究在兩份煙草材料簡(jiǎn)化基因組中共檢測(cè)到2種類(lèi)型SSR位點(diǎn)：P型和C型。P型SSR位點(diǎn)中，二、三核苷酸類(lèi)型出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)到SSR位點(diǎn)總數(shù)的 71.59%，這與童治軍等[19]利用 3份煙草基因組序列數(shù)據(jù)搜索的 SSR位點(diǎn)的基序結(jié)果一致，也與其他作物[3,9,30]基因組中SSR位點(diǎn)的分布特征相符。在SSR基序的結(jié)構(gòu)方面，共發(fā)現(xiàn)298種重復(fù)類(lèi)型的基序，以T/A、AT/TA、TC/GA、CT/AG、AAT/ATT、AAC/GTT、ACA/TGT、GAA/TTC 和AAAT/ATTT基序最為豐富，此結(jié)果與前人在煙草基因組和EST序列研究所得的結(jié)果一致[15,19]，但與水稻[9,30]SSR位點(diǎn)中主要基序類(lèi)型有所不同。另外，C型 SSR位點(diǎn)占總 SSR位點(diǎn)數(shù)的 6.65%，低于BOSAMIA等[31]在花生EST序列中檢測(cè)到10.38%的C型SSR位點(diǎn)，但未有在煙草基因組或EST序列研究中關(guān)于C型SSR位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道。

本研究所獲得的reads和檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)中的基序結(jié)構(gòu)中，均存在富含A、T和較低的G、C堿基的情況，且存在SSR位點(diǎn)的基序中G、C出現(xiàn)的越少，則該基序的分布頻率越高的現(xiàn)象；這一現(xiàn)象在多種真核生物基因組SSR位點(diǎn)中也有發(fā)現(xiàn)[32]。形成這一現(xiàn)象的原因可能是與GC、AT堿基對(duì)之間所含的能量相關(guān)，即AT比GC更容易變動(dòng)[19,32]。

3.2 SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和多態(tài)性SSR標(biāo)記

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序的成本和時(shí)間大大減少，基于基因組序列開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的方法已經(jīng)成為植物研究中 SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的重要手段[33-34]。雖然煙草全基因組測(cè)序已經(jīng)完成[35]，并可根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)出大量的SSR引物組合。但由于常規(guī)栽培煙草品種之間親緣關(guān)系較近，可用的SSR標(biāo)記多態(tài)性水平低，從而造成一些研究成本的增加。如劉文杰等[36]選用 1405對(duì)由 BINDLER等[1,5]和TONG等[37]開(kāi)發(fā)的SSR引物對(duì)煙草青枯病進(jìn)行定位時(shí)，只發(fā)現(xiàn)214（15.23%）對(duì)SSR引物在兩親本材料間（“118-3”和“粵煙 98”）具有多態(tài)性。TONG等[38]選用5718對(duì)依據(jù)基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的SSR引物，對(duì)煙草赤星病進(jìn)行QTL定位時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有227對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)率僅為3.96%。劉文杰等[17]選用90對(duì)前人開(kāi)發(fā)的SSR引物分析94份煙草核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性時(shí)，只有17對(duì)引物檢測(cè)出34個(gè)等位變異位點(diǎn)，平均PIC值只有0.2811。本研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)出23 346對(duì)SSR標(biāo)記引物，并依據(jù)兩個(gè)測(cè)序樣品間的序列數(shù)據(jù)，初步發(fā)現(xiàn) 323對(duì)引物的SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性，以減少在引物合成及其篩選的成本和工作量。在利用 4份煙草材料對(duì)多態(tài)性SSR進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)在兩份測(cè)序樣品中多態(tài)率達(dá)到76%，并發(fā)現(xiàn)24%的假陽(yáng)性，可能是因?yàn)闇y(cè)序結(jié)果有一定的錯(cuò)誤率造成，或者是多態(tài)性驗(yàn)證時(shí)所采用的 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的分辨率不足，造成一部分多態(tài)性SSR標(biāo)記驗(yàn)證結(jié)果錯(cuò)誤[38]。同時(shí)，在另外兩份種質(zhì)材料中也發(fā)現(xiàn)了20%的多態(tài)率，該比率高于牟建英等[39]在“臺(tái)煙 7號(hào)”和“NC89”兩份煙草材料間得到的 4.8%以及高亭亭等[40]在“Beinhart1000-1”和“小黃金 1025”兩份煙草材料間得到的7.2%。值得說(shuō)明的是，多態(tài)性SSR在4份材料之間的多態(tài)率高達(dá)84%，表明開(kāi)發(fā)的多態(tài)性標(biāo)記不僅能夠用于兩個(gè)測(cè)序材料的后續(xù)基因定位，也能用于種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)，基因組或EST序列中SSR位點(diǎn)的重復(fù)序列長(zhǎng)度與所開(kāi)發(fā)出 SSR標(biāo)記的多態(tài)性有關(guān)，即SSR位點(diǎn)的重復(fù)序列越長(zhǎng)，多態(tài)性出現(xiàn)的概率越大，且認(rèn)為當(dāng)SSR位點(diǎn)中重復(fù)序列長(zhǎng)度≥20 bp，多態(tài)性的比例高[33,41]。本研究開(kāi)發(fā)的323個(gè)多態(tài)性SSR中只有2個(gè)重復(fù)序列的長(zhǎng)度低于20 bp，也表明重復(fù)序列的長(zhǎng)度與其多態(tài)性相關(guān)。最后，單從多態(tài)性SSR開(kāi)發(fā)和選用前人開(kāi)發(fā)的 SSR的研究成本角度考慮，由于測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，測(cè)序分析開(kāi)發(fā)多態(tài)性 SSR的研究成本顯著低于選用前人開(kāi)發(fā)的 SSR標(biāo)記，尤其在遺傳距離較近的材料中。綜上所述，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序可快速高效開(kāi)發(fā)煙草多態(tài)性 SSR標(biāo)記，為后續(xù)的 QTL定位和遺傳多樣性分析等研究提供基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)兩份煙草材料“118-3”和“粵煙 98”進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，共檢測(cè)到25 343個(gè)SSR位點(diǎn)，依據(jù)序列設(shè)計(jì)出23 346對(duì)SSR標(biāo)記引物組合；序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)其中323對(duì)SSR引物組合在兩份測(cè)序材料間具有多態(tài)性，試驗(yàn)驗(yàn)證表明其多態(tài)率為76%。研究結(jié)果表明，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序可為煙草具有多態(tài)性SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考，亦可為后續(xù)的QTL定位和遺傳多樣性分析等研究提供基礎(chǔ)。

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