肖 鋒，顧春燕，錢 錚，陳麗燕，孫 艷，肖靜文

南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226006

精氨酸酶-2(arginase-2，ARG-2)是一種雙核含錳的金屬酶，它催化L-精氨酸水解成L-鳥氨酸和尿素，在生物體的新陳代謝中起著十分重要的作用。在人類多種惡性腫瘤中均可以檢測到ARG-2異常表達(dá)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，ARG-2在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中表達(dá)明顯升高，并且ARG-2與HCC組織學(xué)分級相關(guān)［1］。本研究擬進(jìn)一步探討HCC中ARG-2的異常表達(dá)與HCC細(xì)胞增殖、凋亡的相關(guān)問題。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

篩選南通大學(xué)附屬南通市第三醫(yī)院2005年1月—2012年10月經(jīng)手術(shù)切除的158例HCC患者標(biāo)本?；颊吣挲g19～81歲，平均年齡52.9歲；其中男性133例，女性25例；有詳細(xì)的臨床資料，包括血清AFP水平、HBsAg檢測結(jié)果和病理檢查相關(guān)結(jié)果。取上述158例HCC患者中14例的癌組織及相應(yīng)癌旁肝組織新鮮標(biāo)本，和12例肝血管瘤及2例肝外傷患者手術(shù)切除的正常肝組織，液氮凍存?zhèn)溆?。本研究組所有患者術(shù)前均未接受相關(guān)治療，經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書，上報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。術(shù)后電話隨訪本組患者，158例患者中共132例成功隨訪，26例失訪，隨訪時間為3～60個月，隨訪頻率為每3個月1次。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，兔抗人單克隆ARG-2抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人Ki-67單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，兔抗人cyclin D1單克隆抗體購自基因科技(上海)有限公司，小鼠抗人單克隆caspase-3抗體、兔抗人多克隆caspase-8抗體、兔抗人單克隆caspase-9抗體均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔/小鼠通用型二抗工作液及免疫組織化學(xué)試劑盒購自基因科技(上海)有限公司，山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488)熒光二抗、山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor?568)熒光二抗均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 RT-PCR實驗

按TRIzol說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計測定吸光度(D)值260 nm及280 nm值，計算RNA總含量，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品使用說明進(jìn)行，將所獲cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。ARG-2基因上、下游引物分別為：5’-AAGCTGGCTTGATGAAAAGGC-3’，5’-GCGTGGATTCACTATCAGGTTGT-3’，產(chǎn)物長度119bp；GAPDH基因上、下游引物分別為5’-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3’，5’-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3’，產(chǎn)物長度202 bp。反應(yīng)體系：20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共25個循環(huán)；72 ℃ 8 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物加入含2.5%核酸染料瓊脂糖凝膠中，以80 V/cm電壓電泳40 min，在紫外線下可見相應(yīng)長度的目的基因和內(nèi)參的擴增條帶，將電泳結(jié)果直接置于凝膠分析系統(tǒng)中對條帶進(jìn)行分析。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色采用EnVision二步法，參照試劑盒說明書進(jìn)行。所有標(biāo)本經(jīng)4%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織學(xué)方法處理，4 μm厚連續(xù)切片，分別行H-E和免疫組織化學(xué)染色，實驗均設(shè)陽性和陰性對照。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師在“雙盲”條件下進(jìn)行評定。采用半定量積分法對癌細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分。將染色強度分為4級：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細(xì)胞所占的百分比：每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)1 000個癌細(xì)胞，計算細(xì)胞陽性率，無陽性細(xì)胞為0分，1%～10%陽性細(xì)胞為1分，＞10%～50%陽性細(xì)胞為2分，＞50%～80%陽性細(xì)胞為3分，＞80%～100%為4分。將兩組評分相乘所得值，分為3個等級，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～12分為強陽性(++)。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)記染色

手術(shù)新鮮標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中，4 ℃固定6～8 h，再依次移入20%、30%蔗糖溶液中(4 ℃)。待組織塊沉底后，作冰凍連續(xù)切片，片厚5 μm。直接貼于黏附載玻片上，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將切片?80 ℃環(huán)境中取出，37 ℃復(fù)溫1 h后，用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次10 min；滴加二抗來源(山羊)血清封閉室溫2 h；甩去多余血清，加入一抗混合液：兔抗ARG-2(1∶100)以及小鼠抗caspase-3(1∶100)，室溫溫育1 h后4 ℃溫育12～14 h；用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次10 min；擦去多余水分，滴加熒光二抗室溫溫育2 h；用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次10 min；以抗熒光淬滅封片液封片，4 ℃避光保存于濕盒中。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用χ2檢驗分析，各組之間比較采用Spearman秩相關(guān)分析；對隨訪資料用log-rank檢驗并做出Kaplan-Meier生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ARG-2在HCC組織中的表達(dá)情況

在mRNA水平上，ARG-2在正常肝組織、癌旁組織均無表達(dá)。在HCC組織中的表達(dá)明顯增加(圖1)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，HCC組織中ARG-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常肝組織和癌旁組織，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

在蛋白水平上，本研究組已發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示［1］：ARG-2在癌旁肝組織和正常肝組織不表達(dá)，在HCC組織中的表達(dá)高于癌旁肝組織和正常肝組織(P＜0.01)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，ARG-2的陽性染色定位于HCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖2)。

2.2 ARG-2表達(dá)與細(xì)胞增殖相關(guān)分子Ki-67、cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)果顯示，ARG-2表達(dá)與細(xì)胞Ki-67、cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(分別r=0.247 8，P＜0.01；r=0.372 7，P＜0.01，表1，圖2)。

圖 1 RT-PCR分析ARG-2 mRNA在正常肝組織、癌旁組織及HCC中的表達(dá)Fig. 1 RT-PCR analysis of ARG-2 mRNA expression in normal liver tissues, para-cancerous liver tissues and HCC tissues

圖 2 免疫組織化學(xué)檢測ARG-2、Ki-67和cyclin D1在HCC組織中的表達(dá)及定位Fig. 2 Immunohistochemical analysis of the expressions of Arg-2, Ki-67 and cyclin D1 and their localization in HCC tissues

表 1 158例HCC組織中ARG-2表達(dá)與Ki-67、cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 1 The correlation of ARG-2 expression to Ki-67 and cyclin D1 expressions in 158 HCC tissues

2.3 ARG-2表達(dá)與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)的相關(guān)性

本研究組進(jìn)一步運用免疫組織化學(xué)方法分析158例HCC組織中ARG-2表達(dá)與caspase-3、caspase-8和caspase-9表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示：ARG-2表達(dá)與caspase-3、caspase-8表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.191 0，P＜0.05；r=0.180 5，P＜0.05)；而與caspase-9表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.108 9，P＞0.05，表2)。

2.4 ARG-2與凋亡相關(guān)蛋白活化的caspase-3表達(dá)有共定位分析

為進(jìn)一步分析ARG-2與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，我們運用免疫熒光雙標(biāo)記法檢測HCC組織中ARG-2蛋白與活化的caspase-3共表達(dá)情況，結(jié)果顯示，ARG-2與活化的caspase-3存在共表達(dá)(圖3)。

表 2 158例HCC組織中ARG-2表達(dá)與caspase-3, caspase-8, caspase-9表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation of ARG-2 expression to caspase-3, caspase-8 and caspase-9 expressions in 158 HCC tissues

2.5 ARG-2在凋亡癌細(xì)胞中的表達(dá)

運用細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒檢測HCC組織中凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核致密濃染，Arg陽性信號與凋亡細(xì)胞有共定位(圖4)。

2.6 ARG-2蛋白與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性分析

將HCC患者分為ARG-2(-)、ARG-2(+)和ARG-2(++)組，應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，組間生存率比較用log-rank檢驗，結(jié)果顯示：ARG-2(-)組中位生存時間為32個月，ARG-2(+)組中位生存時間為18個月，ARG-2(++)組中位生存時間為15個月，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，ARG-2(-)組高于ARG-2(+)和ARG-2(++)組(χ2=12.278，P=0.002，圖5)。

圖 3 免疫熒光雙標(biāo)記顯示ARG-2與活化的caspase-3有共表達(dá)Fig. 3 Immunofluorescence double labeling showed that ARG-2 was co-expressed with activated caspase-3

圖 4 免疫熒光檢測ARG-2與凋亡細(xì)胞的共表達(dá)情況Fig. 4 The co-expression of ARG-2 and apoptotic cells was detected by immunofluorescence

圖 5 ARG-2(-)、ARG-2(+)和ARG-2(++)組HCC患者生存曲線Fig. 5 Survival curves of HCC patients in ARG-2(-), ARG-2(+) and ARG-2(++) groups

3 討 論

目前發(fā)現(xiàn)Arg存在兩種形式的同工酶：Arg-1型和ARG-2型，兩者大約有60%的氨基酸序列一致，二者主要的區(qū)別在于表達(dá)部位、染色體定位等的不同［2-3］。ARG-2是一種線粒體酶，相對分子質(zhì)量為39×103，其基因定位于14q24.1-24.3染色體，有著廣泛的組織分布，主要在腎臟、腦、小腸、前列腺、乳腺以及巨噬細(xì)胞中表達(dá)［4-5］。ARG-2在不同的組織和器官中發(fā)揮著不同的作用，尤其對人體的新陳代謝、免疫功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，ARG-2表達(dá)與Ki-67、cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)，表明ARG-2與HCC癌細(xì)胞增殖相關(guān)，可能參與調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞增殖過程；已有研究發(fā)現(xiàn)，ARG-2在前列腺癌以及乳腺癌等中表達(dá)水平增加［6-7］；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，過表達(dá)ARG-2能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶2/9 (matrix metalloproteinase 2/9，MMP2/9)表達(dá)，進(jìn)而增強了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及血管生成的惡性生物學(xué)行為能力［8］。表明ARG-2是部分腫瘤細(xì)胞生長、增殖的必需因素。另外，ARG-2通過催化精氨酸生成鳥氨酸，鳥氨酸進(jìn)一步代謝為精胺、亞精胺等多胺，多胺又是細(xì)胞增殖和分化的重要組分，其在促進(jìn)細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮極其重要的作用［9-10］。總之，ARG-2可通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖，而具體調(diào)控HCC增殖的方式還有待進(jìn)一步的研究。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法分析HCC組織中ARG-2表達(dá)與caspase-3、caspase-8和caspase-9表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，ARG-2表達(dá)與caspase-3、caspase-8表達(dá)呈正相關(guān)；免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示，ARG-2與活化的caspase-3有共表達(dá)，并且ARG-2陽性信號與凋亡細(xì)胞有共定位；表明ARG-2可能參與調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的凋亡過程。Shosha等［11］的研究顯示，在缺血再灌注損傷模型中神經(jīng)元血管損傷凋亡是由高表達(dá)的ARG-2所介導(dǎo)的，ARG-2的表達(dá)缺失能明顯減輕神經(jīng)元血管損傷凋亡。McGovern等［12］在Nature雜志發(fā)表的研究結(jié)果表明，ARG-2在人胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，胎兒樹突狀細(xì)胞通過ARG-2的活化促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞增殖，同時抑制T細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)發(fā)揮免疫抑制作用；ARG-2在HCC中的高表達(dá)可能也發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡。ARG-2調(diào)控HCC細(xì)胞凋亡的具體機制還有待進(jìn)一步的研究。另外，本研究還明確了ARG-2蛋白與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，ARG-2陽性表達(dá)提示更差的預(yù)后。

綜上所述，ARG-2可能參與調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞增殖、凋亡的過程，檢測HCC組織中ARG-2的表達(dá)可以作為提示預(yù)后的參考指標(biāo)。進(jìn)一步研究ARG-2影響HCC生物學(xué)行為的作用機制可以為尋找新的HCC治療靶點提供依據(jù)。

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